当单细胞测序的UMAP图上出现一个孤零零的cluster游离在“上皮-免疫” 细胞群之外——它没有常规Marker基因的“身份证明”，在数据库里也查无此人。这不是生信分析的终点，而是一场“细胞身份解码”的开始。在单细胞研究中，聚类得到的cluster0、cluster1……只是一串冰冷的编号，而细胞注释，正是把这些编号翻译成“T细胞”“癌细胞”“巨噬细胞”的“翻译器”，堪称单细胞测序的“第二大脑”。单细胞测序让我们能看清组织中每一个细胞的基因表达，但真正的挑战在于：如何给这些细胞“上户口”？

一、细胞注释的核心逻辑：从 “数字编号” 到 “生物身份”

细胞注释的本质，是通过基因表达特征 “反向推导” 细胞的功能身份。下图中提到的注释流程（图1）清晰展现了这一过程，简单来说分为三步：自动注释打基础、手动注释辨细节、多方验证保准确。

图1 细胞注释流程[1]

(1) 两个层面的注释：既认“细胞身份”，也读“基因密码”

细胞注释不是单一维度的工作，而是从两个层面展开：

• 细胞水平：回答“这是什么细胞”。比如通过CD4、CD8基因识别T细胞亚群，通过CD68标记巨噬细胞，这是最基础的“身份认证”；
• 分子水平：挖掘 “细胞在表达什么特殊基因”。通过热图、UMAP图（图2）展示每个cluster的Top10高表达基因，既能发现已知Marker，还可能找到新的RNA分子——这些“隐藏基因”往往藏着细胞功能的关键线索。

举个例子，当某个cluster高表达Col3al基因，结合GO注释发现它富集在“胶原合成”通路，我们就能推测这可能是成纤维细胞——既认对了“细胞身份”，也读懂了它的“功能密码”。

图2 细胞Marker基因可视化

(2) 三步搞定细胞注释：从工具到逻辑

想要给细胞“精准上户口”，以下总结的“三步法”堪称实用指南：

第一步：参考数据集 “自动匹配”

就像用“人脸比对”找熟人，把待分析数据与公共参考数据集（如CellMarker2.0、PangoDB）比对。比如CellMarker2.0收录了人类445万+细胞的Marker基因，输入基因名称就能查到它常见于哪种细胞——这一步能快速锁定“嫌疑细胞类型”图3）。

第二步：经典 Marker 基因 “贴标签”

如果自动匹配有歧义，就用 “典型Marker” 来验证。比如上皮细胞高表达EPCAM，免疫细胞高表达CD45，这些经过大量研究验证的“身份标签”，能帮我们排除错误注释。Seurat、Scanpy等工具就是通过这类基因，给细胞群 “盖戳认证”。

第三步：功能特征 “深度验身”

对“身份可疑”的细胞，得看它的“行为特征”：通过差异基因分析找到它独有的高表达基因，再用GO、KEGG富集分析看这些基因参与哪些通路（比如“细胞增殖”“免疫应答”），甚至用GSVA分析它的通路活性。这一步能帮我们发现“新亚型”——比如同样是巨噬细胞，有的可能高表达炎症基因，有的则偏向血管生成。

图3 细胞Marker基因查询网站

二、肿瘤中的细胞注释：不只是“认人”，更要“抓坏人”

肿瘤组织的细胞注释，堪称“最复杂的身份识别现场”。这里不只是癌细胞的“独角戏”，还有免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等“群演”，甚至癌细胞自身还会“伪装”“变异”，给注释带来大挑战。

(1) 肿瘤样本的单细胞数据复杂在于：

• 正常细胞→癌细胞：分化失控，异型增生
• 癌细胞高度异质
• 免疫细胞重塑、状态多样

因此，仅靠传统marker难以胜任，需要基因表达特征+CNV异常双重判断。

(2) 癌细胞表达与差异

▶使用癌症相关marker库看表达：如TCGA、OncoKB中已知的癌基因表达特征EPCAM、KRTs（上皮性癌），CDKN2A、MKI67（增殖）等；

▶识别肿瘤 vs.非肿瘤细胞差异：结合CNV（inferCNV（图4）、CopyKAT）识别是否发生染色体拷贝数变异，区分恶性与非恶性细胞，CNV可辅助判断哪些细胞是肿瘤源。

(3) 功能状态注释

▶用GSVA分析肿瘤通路（如EMT、p53、hypoxia）；

▶利用TISCH等数据库查看肿瘤类型下的免疫细胞参考表达谱。

图4 inferCNV分析结果示例

三、巨噬细胞注释：从“一把钥匙”到“多齿密码”

在细胞注释中，巨噬细胞是最“善变”的例子之一。传统上用CD68标记巨噬细胞，但就像一把多齿钥匙，每个“齿纹”都对应不同亚型：

• 注释这些亚型时，不仅要看Marker基因，还要结合拟时序分析（Monocle/Slingshot）追踪其演变路径，甚至联合代谢通路分析，才能揭开它们的 “功能密码”（图5）。

图5 人类免疫细胞与亚型的marker注释示例[2]

四、遇到“查无此人”的细胞？5步攻略破解

当cluster既无Marker，又不匹配参考数据集，别慌！本文给出了“5步注释攻略”：

如果还是难确定，结合空间转录组看它的“位置”——比如靠近血管的细胞可能参与营养运输，靠近肿瘤的可能参与免疫抑制，位置信息能给注释“加buff”。

拜谱小结

单细胞测序为我们打开了“看清细胞”的大门，但走进细胞世界，离不开注释这一“语言翻译器”。从肿瘤微环境的混战中找到关键调控细胞，从免疫细胞的变化中发现疾病机制。拜谱生物依托10x Genomics、墨卓等单细胞平台，结合蛋白组、代谢组等多组学数据，配备丰富的marker数据库和标准化注释流程，帮你打通从“数据挖掘”到“生物学洞察”的最后一公里。欢迎咨询合作！

参考文献：

[1]Clarke ZA, Andrews TS, Atif J, et al. Tutorial: guidelines for annotating single-cell transcriptomic maps using automated and manual methods. Nat Protoc. 2021;16(6):2749-2764. doi:10.1038/s41596-021-00534-0

[2]Kock KH, Tan LM, Han KY, et al. Asian diversity in human immune cells. Cell. 2025;188(8):2288-2306.e24. doi:10.1016/j.cell.2025.02.017