光照和温度是影响植物生长发育的两种重要的环境因素，它们不仅影响植物的形态建成，还调控着植物对环境的适应性。ELONGATED HYPOCOTOYL5（HY5）和PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs（PIFs）是两种重要的植物生长的光调控因子，它们之间的相互作用尚不明确。

2024年8月由中国浙江大学周艳虹教授团队在知名期刊PNAS发表题为“SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato”文章，研究发现，激活的番茄HY5（SlHY5）会触发一个钙依赖蛋白激酶SlCPK27的转录。SlCPK27与SlPIF4相互作用，并在Ser-252和Ser-308磷酸化位点上对其进行磷酸化，以促进其降解。SlPIF4主要通过激活油菜素内酯（BR）生物合成中的一个关键基因SlDWF的转录来促进下胚轴的伸长。这种SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR级联反应不仅在光形态建成中起着至关重要的作用，还调节热形态建成。拜谱生物为该研究提供了RNA-seq技术服务。

英文标题：SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato（PNAS，2024.08）

中文标题：SlCPK27在番茄中通过油菜素内酯依赖的光和热形态建成中交叉连接SlHY5和SlPIF4

客户单位：浙江大学

研究材料：番茄幼苗

拜谱提供技术：RNA-seq

技术路线：

一、研究结果

01. SlCPK27基因的发现和功能确定

前期研究通过RT-qPCR发现SlCPK27表达量在白光(W)、蓝色(B)、红色(R)和远红色(FR)照射下均出现了显著的上升，光感受器突变植株与WT相比，该基因的上升幅度显著下降或不出现上升，说明该基因与植株光感是紧密相关的（图1 A~C）。

为了研究SlCPK27是否在光形态建成中起作用，在黑暗和光照条件下培养了两个纯合子系sicpk27 #2和sicpk27 #6。SlCPK27突变体在黑暗条件下的下胚轴长度与WT相似，但在光照条件下的下胚轴长度明显长于WT。

02.SlCPK27基因与HY5相互作用研究

针对光形态建成重要调节因子HY5的研究中发现，其具有与SlCPK27相似的光响应趋势，在HY5突变植株slhy5 #1和slhy5 - oe的研究中发现，后者植株的下胚轴明显短于WT和slhy5 #1（图2），并发现slhy5 #1突变体中SlCPK27的光诱导表达受到抑制，但与WT相比，slhy5 - oe幼苗中SlCPK27的光诱导表达显著增加（图1D），并进行了电泳迁移转移实验(EMSA)，发现his标记的SlHY5蛋白可以与SlCPK27的启动子结合（图1E）。

后续使用双荧光素酶(LUC)报告系统在烟叶中进行了瞬时表达实验，结果显示SlHY5显著增强了SlCPK27的启动子活性(图1G)。

为了验证SlCPK27和SlHY5之间的遗传相互作用，培育了对应的双突变体，发现其下胚轴长度与SlCPK27突变体接近（图1H）。

图1 SlCPK2与SIHY5相互作用(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Aca

图2 SIHY5突变植株HY5表达与植株萌发情况

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

03.SlCPK27基因与SlPIF4相互作用研究

为了解决slhy5调控SlCPK27如何抑制下胚轴伸长的问题，进一步研究SlCPK27和SlHY5之间的相互作用，作者对WT、SlHY5和SlCPK27幼苗在W光下生长4 d进行了转录组学分析。比值≥2或≤0.5，p值< 0.05的转录本被鉴定为差异表达基因（DEG）。基于这一标准，作者鉴定了416个SlCPK27调控的DEG和890个SlHY5调控的DEG（图3）。

作者通过酵母双杂交(Y2H)筛选来确定SlCPK27的潜在相互作用伙伴，在90个候选物中重点研究了与光信号通路相关的转录因子PIF4，酵母双杂交实验证实了SlCPK27和SlPIF4之间的相互作用（图4A），后使用Pull-down，双分子荧光互补(BiFC)实验验证了二者的互作关系，并在Ca2+处理后增强（图4D）。

在植物体内研究中发现，在slcpk27突变体在光照下的SlPIF4蛋白在核、质积累要比WT高得多(图4E,F)，SlPIF4的光诱导降解被26S蛋白酶体抑制剂MG132抑制，这表明SlCPK27通过26S蛋白酶体途径促进了SlPIF4的光诱导降解（图4G）。

通过生成slpif4突变株和slcpk27/slpif4双突变株，发现二者相较于WT和slcpk27突变株，均表现出了短下胚轴的性状（图4H）。

图3 SlCPK27和SlHY5共调控基因的转录组分析

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

图4.SlCPK27与SlPIF4相互作用

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

PIF蛋白磷酸化是光诱导PIF蛋白降解的先决条件，考虑到光触发Ca2+流入细胞质以促进植物的光形态建成，使用黄化苗进行CaCl2处理和H2O对照探究了Ca2+对该过程的影响，发现CaCl2处理增强了光诱导SlPIF4磷酸化，但EGTA和LaCl3处理抑制了SlPIF4磷酸化；考虑到cpk作为Ca2+信号解译器，作者随后通过使用体外磷酸化反应后纯化的大肠杆菌His-SlCPK27和MBPSlPIF4蛋白进行phos标签迁移转移实验，探索SlCPK27是否直接磷酸化SlPIF4。在His-SlCPK27存在的情况下，观察到MBP-SlPIF4的迁移率移位带，表明SlPIF4在体外被SlCPK27磷酸化（图5A）

Ca2+和光刺激进一步促进了这种磷酸化(图5B,C)，同时，使用抗pSer /pThr抗体进行免疫印迹分析显示，SlCPK27-GFP磷酸化水平和激酶活性在光照后5分钟内增加(图5E)。这些数据共同揭示了SlCPK27以Ca2+和光依赖的方式磷酸化SlPIF4。

图5 SlCPK27磷酸化SlPIF4有助于光诱导SlPIF4蛋白降解

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

04.油菜素内酯(BR)在SlCPK27调控光形态形成中的作用

生长素和BR在pif4调控的下胚轴伸长中起关键作用，slpif4突变体在光照条件下，CS、BL和吲哚-3-乙酸(IAA)含量明显低于WT(图6A-C)，使用24-表油菜素内酯(eBL)和合成生长素picloram (Pic)来区分BR和生长素在slpif4调控的下胚轴伸长中的作用。eBL显著促进了WT的下胚轴伸长，Pic仅部分挽救了slpif4的下胚轴缺陷表型（图7）。

转录组和RT-pcr结果显示slpif4突变体中SlDWF的转录物积累量减少，但与WT相比，其他BR生物合成基因的转录物积累量没有明显变化（图6D）。为了验证SlPIF4是否直接调控SlDWF的表达，作者进行了EMSA，发现MBP-SlPIF4可以结合SlDWF的启动子在所有g -box样基序上(图6E)，并使用ChIP进一步进行了验证（图6F）。

在突变植株研究中发现，sldwf突变体的下胚轴较短，而SlDWF过表达(sldwf - oe)系的下胚轴较长。重要的是，slcpk27突变体(slcpk27 SlDWF)中SlDWF的突变破坏了slcpk27的长下胚轴表型，而slpif4中SlDWF的过表达恢复了slpif4的短下胚轴表型（图6H）。

图6 SlPIF4通过触发BR生物合成负调控光形态建成

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

图7 BR和生长素在slpif4介导的下胚轴生长中的作用

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

05.SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR模块在热形态建成中的作用

除了光，温度也是调节植物生长发育的关键环境线索，为了确定SlHY5-SlCPK27-SlPIF4模块是否也参与热形态建成的调控，将光感受器突变体(slphyA、slphyB1B2、slphyAB1B2和slcry1a)在25℃或32℃的光照下培养。发现温暖环境下WT下胚轴显著增长，但是这一现象在突变体中均减弱或消失（图8A,B），此外，温暖的温度降低了SlHY5蛋白的积累，但增加了SlPIF4蛋白在WT幼苗中的积累(图8C)，温暖温度显著降低了SlCPK27的转录量，增加了SlDWF的转录量，上述变化在突变体中也有所减弱，证实了以上光感受器和SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR通路在植株热形态调控中的作用。

虽然温度显著影响了WT下胚轴长度，但对slhy5和slcpk27突变体的下胚轴长度影响甚微，而对slpif4和sldwf突变体的下胚轴长度没有显著影响（图8F,G），这一现象强调了SlHY5-SlCPK27-SlPIF4模块通过调节BR生物合成在热形态建成中的重要作用。

图8 SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR模块参与番茄热形态建成

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

二、文章小结

光形态和热形态是植株萌发初期重要的调控，本文章通过转录组和WB实验探究了Ca2+参与光信号传导，通过下游信号通路SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR诱导植株下胚轴伸长的过程和相关过程中的调控，如Ca2+流动和磷酸化等。这种多用途信号模块表明，光和温度信号转导可能协同进化，从而赋予植物更大的灵活性，微调其生理过程，以更好地适应环境的动态波动

图9 SlHY5、SlCPK27、SlPIF4和BR组成的光信号调控通路模拟图

(图源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

三、拜谱小结

研究采用了突变株/突变株杂交验证，酵母双杂交，原核表达等实验方案，RNA-seq、RT-qPCR、WB、ChIP-qPCR、Co-IP等检测手段，发现SlHY5在光信号传导中增加SlCPK27的转录，激活光信号的传导，SlCPK27通过磷酸化SlPIF4使其降解，SlPIF4通过直接激活SlDWF基因的转录来调控BR的生物合成，从而抑制了下胚轴的伸长。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋白质组学、修饰蛋白质组学（如超高深度磷酸化修饰）、代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等，助力高分文章发表。欢迎咨询！

参考文献：

Zhu C, Hu Z, Hu C, Ma H, Zhou J, Xia X, Shi K, Foyer CH, Yu J, Zhou Y. SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Sep 3;121(36):e2403040121. doi: 10.1073/pnas.2403040121 Epub 2024 Aug 27. PMID: 39190354；PMCID: PMC11388283