冷胁迫是影响农作物产量的主要环境挑战之一。钙依赖性蛋白激酶（CDPKs/CPKs）可将钙（Ca²⁺）信号传递到细胞并激活对逆境响应的关键调节因子，但其调控机制尚不清楚。

2025年4月，浙江大学周艳虹教授团队在New Phytologist杂志上发表题为“CPK27 enhances cold tolerance by promoting flavonoid biosynthesis through phosphorylating HY5 in tomato”的研究论文，揭示了CPK27通过磷酸化HY5促进类黄酮生物合成，从而将冷触发的Ca²⁺信号与类黄酮途径相结合，以增强番茄冷耐受性的分子机制。本文为理解冷信号转导提供了重要策略，拜谱生物为该研究提供了磷酸化修饰位点检测服务。

英文标题：CPK27 enhances cold tolerance by promoting flavonoid biosynthesis through phosphorylating HY5 in tomato（New Phytologist IF：8.3）

中文标题：CPK27通过磷酸化HY5促进黄酮类化合物的生物合成来增强番茄的耐寒性

客户单位：浙江大学

研究材料：番茄

拜谱提供技术：磷酸化修饰位点检测

研究思路：

一、研究结果

1、CPK27在低温胁迫下表达上调，从而增强植株耐寒性

既往研究表明，CPK27在冷胁迫条件下表达上调。为验证这一结果，本文中作者使用CPK27的两个敲除突变系（cpk27 #2，#6）进行耐寒性测试，发现CPK27的转录水平显著高于对照组（图1a-b）。在CPK27表达被抑制的植物中，对耐寒性的增强作用显著减弱。进一步的亚细胞定位与激活研究表明，冷胁迫促进CPK27向细胞核积累，并增强其磷酸化水平（图1 f）。免疫印迹分析进一步证实冷胁迫诱导 CPK27 在核内蛋白丰度增加、胞内丰度减少，外源CaCl₂处理可部分恢复cpk27的冷敏感表型，表明CPK27依赖Ca²⁺信号发挥作用。（图1g-k）

图1 CPK27以Ca²⁺依赖方式增强番茄耐寒性

2、CPK27通过调控黄酮类合成途径缓解低温损伤

转录组测序结果显示，CPK27的过表达显著上调黄酮类生物合成相关基因，如CHS、CHI和FLS等，同时黄酮类代谢通路显著富集。而CPK27突变体中这些基因表达下调，提示CPK27通过促进黄酮类合成帮助植株缓解低温胁迫带来的氧化压力（图2a-e）。

图2 RNA-seq分析CPK27调控的冷响应基因

3、HY5是CPK27介导的抗寒信号通路中的关键靶标

为验证 CPK27 与 HY5 的相互作用，作者首先进行了酵母双杂交（Y2H）实验，结果证实两者存在相互作用（图3a）。双分子荧光互补（BiFC）实验进一步表明CPK27 与 HY5 在细胞核内发生相互作用（图 3b）。随后通过免疫共沉淀等技术，发现HY5与CPK27在植物体内存在相互作用，且两者的相互作用具有钙离子（Ca²⁺）依赖性（图 3c）。此外，在Co-IP实验的蛋白提取前施加冷胁迫处理，结果显示冷胁迫可增强HY5与CPK27的相互作用（图 3d）。

图3 CPK27与HY5互作并磷酸化其关键位点

4、CPK27磷酸化HY5增强其转录活性，促进黄酮类基因表达

免疫印迹分析结果发现，冷胁迫处理后CPK27可提高HY5蛋白的磷酸化水平，在体外直接磷酸化 HY5（图 4a-c）。通过磷酸化修饰位点检测，发现HY5蛋白的S23和S57两个潜在磷酸化位点。为验证这些位点的功能，作者通过构建非磷酸化突变体，进行磷酸化水平验证，其中双突变体的磷酸化水平下降更为明显（图 4d）。这些结果表明，CPK27 介导的 HY5 磷酸化依赖于 S23 和 S57 这两个特定位点。

图4 CPK27磷酸化HY5并增强其稳定性

5、CPK27 在类黄酮生物合成通路中作用于HY5的上游

综合基因表达和代谢物分析结果（图5），CPK27在冷胁迫响应过程中作用于HY5的上游，通过调控 HY5 介导的类黄酮生物合成通路影响植物耐寒性。

图5 CPK27作用于HY5上游

二、文章小结

综上所述，本文研究表明CPK27磷酸化修饰HY5蛋白，激活类黄酮合成途径，促使抗氧化物质积累，进而增强耐寒能力。该研究阐明了“Ca²⁺-CPK27-HY5-类黄酮”级联调控机制（图6），证实CPK27介导的HY5磷酸化是连接钙信号与次生代谢防御的关键环节，为理解植物逆境响应网络提供了新视角。

图6 CPK27-HY5模块提高植物耐受冷胁迫的机制

三、拜谱小结

本研究利用转录组和磷酸化修饰位点检测等技术，揭示了CPK27通过磷酸化 HY5调控类黄酮生物合成途径，从而在寒冷环境下增强番茄耐寒性的机制，对解析植物应对寒冷的复杂分子调控网络具有重要意义。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋白质组学、修饰蛋白质组学、代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等，助力高分文章发表。欢迎咨询！

参考文献：Lin R, Zhang W, Tian R, et al. CPK27 enhances cold tolerance by promoting flavonoid biosynthesis through phosphorylating HY5 in tomato. New Phytol. 2025;246(5):2174-2191. doi:10.1111/nph.70134