T细胞可以识别恶性细胞表面的主要组织相容性复合体（MHCs）上的肽表位，引起抗肿瘤免疫反应。理论上，抗肿瘤表位可能来自两类抗原：

第一类抗原称为肿瘤相关抗原（TAAs），它们在恶性肿瘤中异常表达或仅在分化的特定阶段产生，而在正常组织中的表达极为有限。TAAs是非突变的自身抗原，其临床应用受限于中央T细胞的耐受性。

第二类则是肿瘤细胞基因组突变（如SNVs、INDEL、基因融合、SVs）所产生的独特肽段，也被称为新生抗原或肿瘤特异性抗原（TSAs）。此外，新抗原也可能来源于异常转录组变异（如转录本选择性剪接、顺式作用元件突变、剪接因子反式作用的改变、无义介导的RNA衰减、多聚腺苷酸化和RNA编辑、非编码区）、蛋白质组变异（如翻译后修饰（PTMs）异常、蛋白酶体加工受损或TAP复合物）和病毒ORF等（图1）。与TAAs相比，新抗原在其独特的肿瘤特异性方面具有明显的优势(表1)，将为有效的肿瘤个性化治疗提供理想的靶点。

表1 TAAs和TSAs的特点

（表源. Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther.2023）

图1 肿瘤新生抗原的产生

(图源：Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther. 2023)

01、免疫原性新抗原的鉴定

免疫基因组学策略是利用NGS来比较肿瘤和正常组织之间的遗传变化。目前，从NGS数据中检测可能新抗原是利用肿瘤和正常的RNA/DNA测序数据来定位肿瘤特异性基因异常。同时，RNA-seq数据与WES结合可以确定肿瘤组织中表达的突变基因，RNA-seq还可以发现更多隐藏的生物信息，如拷贝数变化、微生物污染、转座因子、细胞类型等信息。RNA-seq也可用于检测选择性剪接事件，并估计突变等位基因表达的相对频率。最近的研究表明，当假定无义衰变（NMD）存在时，抗原多肽是由具有移码突变和非典型剪接模式的转录本产生的，为了完全识别由移码突变和异常亚型导致的新抗原，需要来自全长转录本结构的精确肽序列。

基于质谱技术的免疫肽组学可以直接检测免疫沉淀提取的MHC结合多肽，实现高通量鉴定MHC上呈递的多肽（图2）。除了由异常的DNA序列或RNA表达引起的新抗原外，基于MS的蛋白质组学还为蛋白质水平上的新抗原检测提供了“金标准”，这是从DNA和RNA研究中无法发现的。例如，MS可用于检测由细胞转化过程中PTMs失调引起的新型MHC相关新抗原。此外，MS与NGS集成，可进一步检测体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接产生的肿瘤特异性新抗原。整合基因组、转录组和蛋白质组数据，将有利于基于免疫肽组的新抗原鉴定。

图2 基于质谱的新抗原鉴定技术路线

(图源. Bassani-Sternberg, Michal et al.MCP. 2015 )

02、计算机辅助预测新抗原

新抗原预测的典型工作流程可以总结为以下步骤：（i）突变识别，（ii）HLA分型，（iii）基于HLA结合亲和力的新抗原过滤和优先排序，以及（iv）使用基于T细胞的检测对免疫原性新抗原进行实验验证（图3）。

图3 新抗原预测的计算工作流程

（图源：Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther. 2023）

基于MHC分子的加工和呈递过程，已经创建了许多用于计算机预测的工具来发现新抗原，包括NetChop、NetCTL和NetCTLpan等（图3）。通过将HLA-配体数据纳入机器学习算法，已经显著提高了预测能力。NetMHCpan和MHCflurry利用体外Peptides-HLA Binding数据集来训练机器学习模型，是当前HLA配体识别管道的主要组成部分，与最先进的方法相比，NetMHCpan通过整合结合亲和力数据和MS多肽组数据，为MHC-I等位基因提供一种“全特异性”机器学习策略，提高了肿瘤新抗原的预测性能。最近的两项研究创建了名为MSIntrinice和EDGE的计算框架，利用从RNA-seq和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）数据中获得的HLA肽，可以高效地预测HLA抗原。

新的证据已经证明了MHC-II新抗原在抗肿瘤免疫反应中的重要意义。利用人工神经网络开发了大量预测MHC-II结合表位的计算技术，包括NetMHCII、NetMHCIIpan、RNAKPEP、MULTIPRED2、ProPred和MHCPred。然而，与MHC-I分子相比，MHC-II-peptides结合亲和力的计算预测目前还不那么精确。近年来，基于转录组和质谱数据的计算方法已经发展起来。在淋巴瘤数据训练集中，由MARIA训练的深度学习模型优于最广泛使用的NetMHCIIpan3.1。然而，还需要更多的研究使用重要的数据集来证明其稳健性和有效性。

大多数通过MHC分子呈递预测的新抗原不会触发免疫反应。因此，在评估潜在新抗原的免疫原性时，尤其需要考虑pMHC复合物的TCR识别。计算机模型可以预测新抗原特异性T细胞的识别，如NetCTL/NetCTLpan和基于机器学习的TCR-peptides/-pMHC binding。然而，由于TCR对其pMHC配体的低亲和力，预测TCR和pMHC的结合亲和力仍然具有挑战性。

03、候选新抗原免疫原性的评价与验证

新抗原反应性T细胞通常利用T细胞检测、多色标记的MHC四聚体、酶联免疫吸附点（ELISpot）和T细胞文库分析进行验证或筛选。T细胞免疫原性检测是评价候选新抗原免疫原性最直接的方法。通过癌症外显子组/RNA-seq发现的一整套可能的突变多肽，都可以使用来自癌症患者或健康捐赠者的T细胞进行检测。这些技术依赖于表位预测，通量较低，因为它们只能有效地生成MHC I类等位基因的一个子集。将单细胞RNA测序（scRNA-seq）与应答细胞群的TCR测序相结合，可用于提高检测的灵敏度。

一些无偏的TCR-guided新抗原发现策略已经被开发出来系统地描述新抗原特异性TCR。酵母展示的pMHC文库可用于发现新抗原特异性TCR，然而，制备可溶性TCR试剂是一个耗时的过程，如果没有新抗原的内源性处理或T细胞的功能激活，所识别的随机肽可能不能代表生理上的TCR-pMHC相互作用。为了克服这些缺点，可以利用不同的生物过程在共培养系统中标记目标细胞。一种方法利用被称为信号传导和抗原呈递双功能受体（SABRs）的嵌合受体，它可以在pMHC-TCR相互作用后诱导TCR样信号。SABRs能够成功识别TCR-pMHC相互作用，可用于已知的公共TCR和个体新抗原特异性TCR。T-Scan是一种独立于预测算法的TCR表位扫描方法，它依赖于T细胞杀伤的生理活性，比以前的方法产生更大的抗原空间。因此，这些发现TCR配体的新兴方法将有助于研究候选新抗原的免疫原性，为免疫治疗提供新的靶点。

04、总结

下一代测序技术和生物信息学技术的不断发展，加速了肿瘤特异性新抗原的快速识别和预测。通过了解新抗原诱导的抗肿瘤免疫反应的机制，以及通过简化基于新抗原的免疫治疗的过程，将有助于癌症治疗的快速发展。

拜谱小结

肿瘤新生抗原（neoantigen）是由体细胞突变产生的能诱导肿瘤特异性T细胞识别的多肽，是一种肿瘤特异性抗原，是肿瘤免疫治疗的理想靶点。目前基于新生抗原的研发已被广泛应用于肿瘤疫苗、过继性免疫细胞治疗、抗体药等多个方面。新抗原的鉴定是开发有效免疫疗法的关键步骤。鉴定新抗原表位有两种主要策略：①免疫基因组学方法：基于高通量测序的计算机方法创建虚拟肽组；②免疫肽组学方法：使用质谱分析MHC结合肽段。拜谱生物作为国内领先的多组学公司，可提供完善成熟的蛋白组学、代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。近期，拜谱生物将推出基于质谱分析的免疫肽组检测服务，敬请期待！

参考文献

1.Xie N,Shen G,Gao W, et al. Neoantigens: promising targets for cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 2023;8 (1):9. doi:10.1038/s41392-022-01270-x

2.Bassani-Sternberg M,Pletscher-Frankild S,Jensen LJ, et al. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol Cell Proteomics. 2015;14 (3):658-73. doi:10.1074/mcp.M114.04281