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定量蛋白质组学

一、 ITRAQ标记定量蛋白质组学分析       

iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation, iTRAQ)是由AB SCIEX公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用4种或8种不同签的同位素试剂特异性地标记不同样品中的蛋白多肽氨基基团,标记的样品等量混匀后,经液相色谱分离及串联质谱(MS/M)分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对表达量信息,通过生物信息学分析即可鉴定出所测蛋白及其在各样品中的表达差异 。       

 

iTRAQ试剂由三部分组成:报告基团、质量平衡基团和反应标记试剂基团,形成4种或8种相对分子质量均等量(145或305)的异位标签iTRAQ试剂用于标记酶解后的肽段。在质谱中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中,报告基团、质量平衡基团和多反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签的同一多肽产生不同的报告离子,根据报告离子的信号强度可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。       

 

定量蛋白质组学

技术特点       

 

1、灵敏度高:可检测出较低丰度蛋白,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等;

2、分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白,小于10K或大于200K的蛋白、难溶性蛋白;

3、高通量:可同时对8个样本进行分析,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析;

4、结果可靠准确:定性与定量同步进行,同时得出鉴定和定量结果,重复样品间的蛋白表达量相关性可达到0.95以上;

5、兼容性高:标记所有的肽段,包括翻译后修饰,提高了蛋白质组的覆盖率,而且提高了鉴定和定量的可信度。       

 

ITRAQ 标记定量流程:       

 

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二、TMT标记定量蛋白质组学分析       

TMT™(Tandem Mass Tag™)技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。TMT与iTRAQ试剂在结构和检测原理上基本类似,也是由报告基团、平衡基团和肽反应基团三部分组成。  该技术采用2种、6种或10种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较2组、6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量。其技术特点与iTRAQ类似。       

 

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三、LABEL-FREE 非标记定量蛋白质组学分析       

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四、SILAC定量蛋白质组学       

细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC),利用含轻、中或重型同位素标记的必需氨基酸(主要是Lys和Arg)培养基培养细胞,来标记细胞内新合成的蛋白质,一般培养5-6代,细胞中的蛋白质将都被同位素标记。不同处理的蛋白样品等量混合,经SDS-PAGE分离,切胶,酶消化,LC-MS/MS分析即可得到有关蛋白的定量及定性结果。   SILAC在比较蛋白质组学,蛋白与蛋白互作,蛋白与DNA互作,蛋白与RNA互作等研究领域均有广泛应用。       

 

1、高通量,可同时标记细胞内的蛋白,与质谱联用可同时分析鉴定多种蛋白;

2、同位素标记效率高、稳定,不受裂解液影响,结果重复性好,可信度高;

3、灵敏度高,实验所需蛋白量明显减少;

4、体内标记,结果更接近真实生理状态       

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