蛋白质磷酸化修饰是生物体内存在极为广泛的一种翻译后修饰类型，调节了包括细胞增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有活动。分析研究蛋白质的磷酸化修饰状态，有助于进一步发掘与疾病发生发展相关的重要生物标志物。
近年来液相色谱-质谱连用技术为核心的“鸟枪法（shotgun）”蛋白质组学快速发展，磷酸化肽段/蛋白质富集及分级技术的进步，磷酸化肽段质谱碎裂方式、高速扫描高质量精度质谱以及磷酸化肽段定性定量相关软件的巨大发展，这些均为大规模、高通量蛋白质磷酸化分析提供了有力的基础。目前的蛋白质磷酸化分析中，在保证实验结果可靠准确的同时，在一次实验中可对成千上万个磷酸化位点同时进行分析表征。
酸性条件下TiO2带正电荷，可与样品中磷酸化肽段上带有负电荷的磷酸基团特异性结合，经清洗缓冲液洗去非磷酸化肽段后，用碱性洗脱液可以将结合在TiO2上的磷酸化肽段洗脱下来，从而达到特异性富集磷酸化肽的目的。为最大限度排除肽段混合物中带负电荷的酸性非磷酸化肽段与TiO2非特异性结合带来的干扰，会在酸性的TiO2富集缓冲液中加入2,5-二羟基苯甲酸。磷酸化肽富集完成后，利用液相色谱-串联质谱对其进行检测。
技术特点
分辨率高：精确鉴定蛋白的磷酸化位点，可定位到单个氨基酸位点的磷酸化修饰。
高效率：一次实验可鉴定几千种磷酸化位点，快速构建磷酸化蛋白修饰谱。
多种碎裂模式选择：可提供CID、ETD或者HCD等多种碎裂模式，提到蛋白质鉴定率。
样品要求
样品类型 | 样品要求 |
植物叶片 | 湿重≥3g |
植物根茎、木质部、韧皮部等 | 湿重≥5g |
细胞样品 | 细胞量湿重≥5*107 |
组织样品 | 人、动物、微生物湿重≥50mg； |
体液样品 | 血清、血浆体积≥200μl，、脑脊液≥500μl，尿液≥1000μl |
技术流程
应用案例
1. Chumbalkar V, Latha K, et al. Analysis of phosphotyrosine signaling in glioblastoma identifies STAT5 as a novel downstream target of DeltaEGFR. J Proteome Res. 2011; 10(3): 1343-52.
2. Wang S, Wang J, et al. PKC-mediated USP phosphorylation at Ser35 modulates 20-hydroxyecdysone signaling in Drosophila. J Proteome Res. 2012; 11(12): 6187-96.
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蛋白质组学送样表（拜谱生物）