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定量N糖基化蛋白质组分析

蛋白质的N-糖基化位点修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,主要在复杂的多细胞或组织形成过程中起关键作用,参与细胞与细胞的连接、受体配体的相互作用、免疫应答、细胞凋亡及各种发病机理等生物学过程。蛋白质的N-糖基化修饰位点具有保守的氨基酸序列NX(S/T),其中X为除脯氨酸以外的其它氨基酸。

 

糖分子自身的复杂性和许多N-glycoproteins低表达水平使得对N-glycosylation结构的表征的描述极为困难。在检测低丰度的N糖基化修饰蛋白或肽段时,其中掺杂大量未修饰的蛋白肽断,这很容易将低丰度的糖基化修饰蛋白肽段的信号掩盖,目前采用凝集素亲和富集解决这一问题。

 

定量N糖基化蛋白质组分析

 

凝素亲和法是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。凝集素(lectin)是一类糖结合蛋白质,能专一识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与之结合,它们与糖链可逆非共价结合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后,通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。蛋白质经过酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)在H218O中切除连接在天冬酰胺残基(Asn)上的糖链。该处理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS质谱仪检测脱糖后的肽段,通过检索数据库,确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列,从而确定该蛋白质的N-糖基化位点。

 

N-糖基化位点确定之后,再利用label-free的原理对其进行定量分析。

 

应用领域

 

1.不同实验条件下糖基化蛋白质组变化及信号通路分析;

2.筛选候选糖蛋白标志物;

 

技术流程


定量N糖基化蛋白质组分析

 

技术特点

 大规模的蛋白质组N-糖基化位点的鉴定与分析。


样品要求


样品类型

样品要求

植物叶片

湿重≥3g

植物根茎、木质部、韧皮部等

湿重≥5g

细胞样品

细胞量湿重≥5*107

组织样品

人、动物、微生物湿重≥50mg;

体液样品

血清、血浆体积≥200μl,、脑脊液≥500μl,尿液≥1000μl


应用案例

Zielinska DF, Gnad F, et al. Mapping N-glycosylation sites across seven evolutionarily distant species reveals a divergent substrate proteome despite a common core machinery. Mol Cell. 2012; 46(4): 542-8.


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