自身免疫性疾病是由身体对自身抗原的免疫反应引起的，这会导致身体组织的损伤。其中，类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)以炎症为主要特征。然而，这些疾病的发病机制仍不清楚，开发减少副作用的药物也迫在眉睫。
近年来，未折叠蛋白反应(UPR)因其在炎症性疾病中的重要作用而受到广泛关注。肌醇酶 1α(IRE1α)是由内质网核信号1 (ERN1)基因编码的，是UPR的重要分子传感器，在真核细胞中具有广泛的功能。IRE1α的激活促进多种炎症因子的产生，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和IL-1β。此外，TRAF6介导的IRE1 α泛素化调控Toll样受体(TLR)诱导的IRE1 α在促炎症细胞因子产生中激活。因此，设计一种高效的靶向ERN1的小干扰RNA——siERN1能够特异性地敲除IRE1 α的表达，其作用可作为治疗类风湿性关节炎（RA）或其他自身免疫性炎症疾病的一种潜在策略。
2021年9月29日，重庆医科大学基础医学院的郭风劲教授作为通讯作者，冯乃波博士作为第一作者，在国际知名TOP期刊《ACS Nano》中发表了一篇题为“Treating Autoimmune Inflammatory Diseases with an siERN1-Nanoprodrug That Mediates Macrophage Polarization and Blocks Toll-like Receptor Signaling”的文章。该研究证实siERN1纳米前药可以通过调控Ca2+浓度来调节巨噬细胞的极化，并且证实了ERN1是自身免疫性炎症疾病的有效靶点，从而为理解siERN1药物及其潜在机制提供了有效见解，为进一步开发siERN1药物奠定了坚实的基础。siERN1药物的构建与鉴定可能会扩大创新纳米药物和基因治疗在各种病理和疾病中的应用。在该研究中拜谱生物提供了LFQ定量蛋白质组学检测与分析。
Treating Autoimmune Inflammatory Diseases with an siERN1-Nanoprodrug That Mediates Macrophage Polarization and Blocks Toll-like Receptor Signaling
用siERN1纳米前药介导巨噬细胞极化并阻断toll样受体信号传导，从而治疗自身免疫性炎症性疾病
期刊：ACS Nano
影响因子：15.881
发表时间：2021年9月29日
拜谱提供服务：LFQ定量蛋白质组学
研究对象：IP沉淀
作者信息：冯乃波博士作为第一作者，郭风劲教授作为通讯作者
作者单位：重庆医科大学基础医学院
1. RA患者的IRE1 α表达与磷酸化水平
Western blotting：与正常软骨相比，骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)软骨中的IRE1 α水平上调，且RA软骨中的IRE1 α水平显著升高。此外，在RA样本中，IRE α磷酸化水平显著升高，代表RA软骨组织中较高的激活水平。此外，XBP 1s在RA软骨中表达较高。XBP 1s是内质网应激时由磷酸化激活的IRE1α (p-IRE1α)裂解产生，同时IRE1α也促进巨噬细胞中促炎因子的释放。因此，IRE1 α的表达和磷酸化与RA的发病和发展有关。
2. siERN1纳米前药输送系统的设计、构建和表征用小干扰RNA（siRNA）下调ERN1可以降低促炎细胞因子的表达，该研究设计了一种能够实现siERN1靶向药物输送到巨噬细胞的特异性纳米材料——FA - PEG - R - NPs@siERN1。在siERN1纳米前药最终组装后，利用各种技术对其进行了表征。最终，纳米前药具有合适的粒径和表观ζ电位，优越的生物相容性和良好的反应性，这些特点为后续的实验研究奠定了基础。
3. FA - PEG - R - NPs@siERN1在CIA模型中的治疗作用
荧光实验：由于叶酸（FA）的存在，该纳米前药可以准确地将siERN1药物靶向到炎症关节；聚乙二醇（PEG）的存在一方面可以延长siERN1纳米前药在体内的循环时间，另一方面也可以将FA与PEG接枝，实现siERN1纳米前药的靶向输送。
药物疗效：使用关节炎评分对疾病进展的控制进行综合评价。结果显示，FA - PEG - R - NPs@siERN1治疗组小鼠关节炎评分呈缓慢上升趋势，末次治疗平均评分仅为2.7分，治疗效果最佳。
后爪厚度：总体上，各组后爪厚度的变化趋势大致对应关节炎评分的变化趋势。第48天采集小鼠双后爪图像，结果显示FA - PEG - R - NPs@siERN1组可以显著抑制小鼠后爪和关节肿胀，平均后爪厚度为2.81 mm，而其他组与对照组相比厚度仍然较厚。
综上所述，FA - PEG - R - NPs@siERN1可显著减缓类风湿性关节炎（RA）的进展，有效抑制胶原性关节炎（CIA，RA基础研究常用模型）小鼠后爪和关节肿胀，具有较好的治疗效果。
4. FA - PEG - R - NPs@siERN1对CIA模型关节软骨的保护作用。
显微CT：FA - PEG - R - NPs@siERN1组小鼠关节表面光滑平整，无骨丢失迹象。而其他组则出现不同程度的关节损坏，表现为关节模糊甚至关节融合。定量分析骨密度(BMD)和骨体积百分比(BV/TV)，结果表明FA - PEG - R - NPs@siERN1能有效防止骨丢失。
苏木精-伊红(HE)染色：FA - PEG - R - NPs@siERN1组表现出最佳的炎症控制和软骨保护效果。在FA - PEG - R - NPs@siERN1组中，siERN1制剂能有效抑制肥大滑膜衬里细胞层侵入关节腔，保护半月板和关节软骨的完整性。此外，进一步评估了FA - PEG - R - NPs@siERN1对CIA模型炎症控制和软骨保护的影响。
综上，FA - PEG - R - NPs@siERN1对CIA模型的治疗效果最好。FA - PEG - R - NPs @ siERN1能有效控制关节局部炎症，有效保护关节软骨和软骨下骨免受炎症损伤。
5. FA - PEG - R - NPs@siERN1在CIA模型免疫调节和炎症控制中的作用
据报道，T淋巴细胞在免疫调节中发挥重要作用，是细胞介导免疫的执行细胞；CD45+CD3+CD4+T细胞与CD45+CD3+CD8+T细胞的比值是评价机体免疫状态的重要参考价值。
流式细胞术：计算淋巴结和脾脏中的细胞比例，结果表明FA - PEG - R -NPs @ siERN1能成功调节CIA小鼠的全身免疫状态，抑制免疫调节的过度激活。
据报道，T helper 17 (Th17)和T regulatory (Treg)细胞之间的失衡在自身免疫性疾病的发生发展中发挥着重要作用：Th17细胞是促炎亚群，可促进自身免疫和组织损伤；而Treg细胞具有免疫抑制作用，可抑制自身免疫。
流式细胞术：结果显示，FA - PEG - R - NPs@siERN1上调Treg细胞比例，同时下调Th17细胞比例。FA - PEG - R - NPs@siERN1促进Th17和Treg细胞之间的平衡向Treg分化倾斜，有助于防止免疫系统的过度激活。
Western blotting & RT-qPCR：检测CIA小鼠受损伤关节区域的局部炎症程度。结果显示，FA - PEG - R - NPs@siERN1组的三种促炎细胞因子IL-1β、IL - 6和TNF-α的表达最低，说明FA - PEG - R - NPs@siERN1显著抑制了上述三种促炎细胞因子在关节滑膜中的表达。
因此，FA - PEG - R - NPs@siERN1可以调节机体免疫状态，恢复体内平衡，抑制炎症。
6. FA - PEG - R - NPs@siERN1对DSS诱导的IBD模型的治疗作用
炎症性肠病（IBD）是一种常见的自身免疫性炎症性疾病，该研究客观评价了FA - PEG - R - NPs@siERN1对于葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD模型的治疗效果，进一步验证了其普遍适用性。
体重：FA - PEG - R - NPs@siERN1逐渐控制住了小鼠的体重减轻，而其他各组小鼠表现出不同程度的体重减轻。
结肠长度：FA - PEG - R - NPs@siERN1将IBD小鼠的结肠长度维持在大约8.2 cm(正常结肠的平均长度为9.0 cm)，而其他组都较短，表明其可以抑制IBD小鼠的肠道症状，减轻炎症和体重减轻。
组织病理学分析：在FA - PEG - R - NPs@siERN1组中，观察到较为完整和正常的肠道结构，包括致密的杯状细胞和隐窝结构。肠各层均未见结肠溃疡或明显的炎症细胞浸润。然而，在其他四组的肠道组织中均观察到肠道损伤，包括坏死和结肠溃疡。
淋巴细胞比例：FA - PEG - R - NPs@siERN1处理小鼠组中CD45+CD3+CD4+IL-17+T淋巴细胞的比例为6.35%，CD45+CD3+CD4+FoxP3+T淋巴细胞的比例为17.4%。FA - PEG - R - NPs@siERN1能促进T细胞向Treg细胞分化，降低Th17细胞比例，促进机体免疫状态恢复平衡。
炎症因子&巨噬细胞：FA - PEG - R - NPs@siERN1不仅抑制了促炎细胞因子的表达，而且上调了抗炎细胞因子的表达。结果还显示，FA - PEG - R - NPs@siERN1处理组中M2巨噬细胞比例增加，M1巨噬细胞数量减少，说明FA - PEG - R - NPs@siERN1促进了M2巨噬细胞的极化，从而调节机体恢复稳态。
综上，FA - PEG - R - NPs@siERN1可以通过调节免疫状态、控制体重减轻、保护小鼠结肠的正常结构、降低局部和全身炎症水平来缓解小鼠IBD进展。
7. siERN1在恢复免疫稳态和缓解炎症中的作用机制
IRE1 α是一种内质网跨膜传感器，已有研究证实IRE1 α与内质网的功能及分泌途径有关。最近的研究表明，IRE1 α的一种非经典功能与IP3R有关，它通过控制细胞内Ca2+浓度和各种细胞代谢活动来调节钙信号转导。
视觉分子动力学(VMD) & 免疫共沉淀：预测 & 验证IRE1 α与IP3R的两个亚型IP3R1和IP3R3相互作用。
荧光强度和流式细胞术：LPS诱导的M1巨噬细胞中Ca2+浓度增加。过表达ERN1增加了细胞内Ca2+浓度，而通过siRNA沉默ERN1则降低了其浓度。
已有研究报道，巨噬细胞Ca2+浓度影响巨噬细胞极化的调节。
RT-qPCR：正如所料，ERN1沉默后，M2巨噬细胞标志物的mRNA上调表达，包括Arg和CD206，而M1巨噬细胞标志物CD86和iNOS的mRNA下调表达。结果证实siERN1纳米前药通过下调ERN1的表达降低ERN1的作用及其与IP3R1/3的相互作用，阻止Ca2+通过内质网（ER）进入细胞质，进一步干扰细胞内Ca2+浓度，从而抑制巨噬细胞M1极化，促进M2极化。
为了确定参与IRE1 α介导的炎症调节的分子，采用无标记（LFQ）定量蛋白质组学方法检测IL -1β处理后的IRE α富集蛋白。
处理组和对照组中分别鉴定到22和105个与IRE1 α相关蛋白；这些蛋白在炎症过程中表现出明显不同的富集程度。MyD88的表达水平与ERN1相关，并在IL -1β处理后显著上调。MyD88是TLR信号通路中的关键连接分子，在上游信息传递和疾病发生发展中发挥着重要作用。据报道，TLR信号通路通过控制炎症介质的产生与RA滑膜炎和关节破坏有关。数据显示，siERN1下调MyD88依赖的TLR信号通路分子的表达，而ERN1过表达上调了该通路中相同分子的表达，包括TRAF6、IRAK4、p-p38/p38、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB。提示IRE1 α参与调控MyD88依赖的TLR信号通路，这表明FA - PEG - R - NPs@siERN1在炎症性疾病中发挥着重要作用。作者投入了大量的精力来证明FA - PEG - R - NPs@siERN1作为巨噬细胞极化的调节因子，并阻断MyD88依赖的TLR信号通路。此外，结果显示，siERN1纳米前药不会导致CIA小鼠对细菌感染的易感性增加。
综上所述，siERN1纳米前药能够控制CIA小鼠的疾病，通过促进M2巨噬细胞极化分泌抗炎细胞因子、巨噬细胞与T细胞相互作用、FoxP3上调、Treg/Th细胞稳态等途径维持正常免疫状态。尽管纳米前药在小鼠体内的效果不能等同于在人体内的作用，但siERN1纳米前药在未来可以作为一种可靠的给药方法用于临床应用。
该研究证实了siERN1纳米前药可以通过调节Ca2+浓度来调节巨噬细胞的极化，并作为MAyD88依赖的TLR信号的拮抗剂，为抑制这一基本炎症通路和治疗各种TLR相关疾病提供了一种有前景的方法，包括自身免疫性炎症疾病。此外，该研究证实了ERN1是自身免疫性炎症疾病的有效靶点，从而为理解siERN1药物及其潜在机制提供了充满希望的见解，也为进一步开发siERN1药物奠定了坚实的基础。siERN1药物的构建与鉴定可能会扩大创新纳米药物和基因治疗在各种病理和疾病中的应用。
参考文献：Feng N, Liang L, Fan M, Du Y, Chen C, Jiang R, Yu D, Yang Y, Zhang M, Deng L, Li X, Geng N, Xian M, Qin Q, Li X, Tan Q, Luo F, Song F, Qi H, Xie Y, Guo F. Treating Autoimmune Inflammatory Diseases with an siERN1-Nanoprodrug That Mediates Macrophage Polarization and Blocks Toll-like Receptor Signaling. ACS Nano. 2021 Sep 29. doi: 10.1021/acsnano.1c03726. Epub ahead of print. PMID: 34586802.
