肝癌是全球第四大癌症杀手，并且 5 年的生存率仅有18%，是第二大致命肿瘤。在所有肝癌病例中，肝细胞癌(HCC) 是主要类型，约占 89%。肝炎和酗酒以前被认为是 HCC 的主要危险因素，但目前，非酒精性脂肪肝(NAFLD) 被认为是一个日益增加的危险因素。代谢失调有助于 NAFLD 发展为 HCC。由于活性氧 (ROS) 与代谢过程密切相关，ROS 可能在 HCC 发展中发挥重要作用，尤其是那些从 NAFLD 发展的 HCC。
索拉非尼是 FDA批准的第一个多靶点酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，可抑制肿瘤血管生成并对晚期HCC 患者显示出明显的临床获益。尽管有疗效，但索拉非尼的临床有效性在很大程度上受到耐药性发展的限制。然而，ROS 在索拉非尼疗效和耐药性中的作用仍然不清楚。
2021年5月18日，浙江大学邵逸夫医院的蔡秀军，梁霄，王一帆三位共同通讯在Signal transduction and targeted therapy中发表了题为“UBQLN1 mediates sorafenib resistance through regulating mitochondrial biogenesis and ROS homeostasis by targeting PGC1β in hepatocellular carcinoma”的文章，该文旨在阐明线粒体生物发生介导的 ROS 水平在 HCC 索拉非尼耐药中的作用机制。
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UBQLN1 mediates sorafenib resistance through regulating mitochondrial biogenesis and ROS homeostasis by targeting PGC1β in hepatocellular carcinoma
UBQLN1通过靶向肝细胞癌中的PGC1β调控线粒体生物发生和ROS稳态进而介导索拉非尼耐药性
期刊：Signal transduction and targeted therapy
影响因子：18.187
中科院分区：一区
发表时间：2021年5月18日
通讯作者：蔡秀军，梁霄，王一帆三位共同通讯
作者单位：浙江大学邵逸夫医院
样本类型：肝癌细胞
拜谱提供服务：LFQ定量蛋白组学检测与分析
体外模型，建立三对亲本（HCCLM3\SK-Hep-1\HepG2）和耐药（-SR）细胞系，对索拉非尼具有不同程度的耐受性。
亲代细胞ROS水平：索拉非尼处理诱导了亲代细胞中 ROS 的产生。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）一定程度上减少了索拉非尼诱导的细胞死亡，表明索拉非尼可能通过增加 ROS 水平诱导细胞死亡。
耐药细胞ROS水平：与亲代相反，索拉非尼降低了耐药 HCC 细胞中的 ROS 水平，而且NAC 不能减少索拉非尼在耐药 HCC 细胞中诱导的细胞死亡。然而，随着过氧化氢（一种 ROS 诱导剂）的浓度增加，可以一定程度上减少索拉非尼的耐药性。
因此，在耐药细胞中观察到响应索拉非尼处理的 ROS 水平降低可能对 HCC 中索拉非尼耐药的发展至关重要。
先前的研究发现，索拉非尼靶向线粒体 ETC 复合物以诱导 ROS。为了阐明响应索拉非尼的 ROS 差异的潜在机制，作者进一步研究了线粒体在索拉非尼耐药过程中的作用。
线粒体膜电位（MMP）：采用流失细胞术技术，MMP在两种细胞系中都因索拉非尼处理而降低，但在耐药细胞中降低的程度要小得多。
线粒体形态学：采用透射电子显微镜（TEM）分析表明，索拉非尼处理 48 小时后，亲代细胞中的线粒体嵴部分解体，而耐药细胞中的线粒体基本保持完整，表明索拉非尼处理下的耐药细胞表现出更好的线粒体功能。
线粒体数量及其DNA（mtDNA）：耐药细胞中的线粒体数量和mtDNA水平低于亲本细胞，表明当用索拉非尼治疗时，耐药细胞中较低的线粒体含量可能导致较少的 ROS 产生。
耗氧率（OCR）：耐药细胞的OCR低于亲本细胞，表明线粒体呼吸能力降低，这可能是耐药细胞线粒体数量减少的结果。
氧化还原离子对：与亲本细胞系相比，在耐药细胞系中发现了相对还原状态。
这些结果表明耐药细胞保留了更好的线粒体功能和完整性，线粒体含量和呼吸能力降低，导致响应索拉非尼处理的 ROS 产生减少并持续产生索拉非尼耐药性。
线粒体自噬：索拉非尼处理下，无论是否使用氯喹（一种经典的自噬抑制剂），耐药细胞的LC3II（反映自噬活性）水平都较低。此外，耐药细胞中线粒体自噬特异性标志物 PARKIN 和 PINK 的水平也降低。荧光成像进一步揭示了在索拉非尼治疗下，耐药细胞中的自噬通量低于亲本细胞。
这些结果表明，在索拉非尼处理下，耐药细胞中的线粒体自噬减少，这不太可能解释耐药细胞中线粒体含量较低的原因。
线粒体生物发生：首先检测了PGC1α和PGC1β（调节线粒体转录因子 A (TFAM) 以维持 mtDNA 水平和线粒体功能）的蛋白水平。耐药细胞系中PGC1β 表达降低，而 PGC1α 表达几乎没有变化。此外，耐药细胞中 TFAM 的mRNA 水平也降低，并且过表达 PGC1β 导致TFAM mRNA 和ROS 升高以响应索拉非尼处理。
这些结果表明耐药细胞中 PGC1β 的降低可能导致线粒体生物发生和 ROS 生成减少以响应索拉非尼处理。
PGC1β上游调控：耐药细胞中PGC1β mRNA 水平升高，而蛋白降解加速。此外，通过添加 MG132 阻断蛋白酶体可将耐药细胞中的 PGC1β 蛋白增加至亲代细胞中的同等水平或更高水平。
这些结果表明，与亲本细胞相比，耐药细胞中蛋白酶体介导的 PGC1β 降解加速。
发现表明耐药细胞中 PGC1β 降解加速，导致线粒体生物发生和 ROS 生成减少以响应索拉非尼治疗。
为了剖析体内索拉非尼耐药的潜在机制并进一步阐明HCC耐药中PGC1β加速降解的详细机制，该研究构建了皮下索拉非尼耐药HCC小鼠模型，采用质谱法对亲本和耐药肿瘤进行蛋白质组学分析。
差异蛋白功能分析：发现80 个差异蛋白（p<0.05）。通过GO分析表明，代谢过程和线粒体组织在耐药中发生变化，与体外结果一致。KEGG 通路分析进一步表明泛素介导的蛋白水解可能在索拉非尼耐药中发挥作用。
代谢过程和泛素介导的蛋白水解在索拉非尼耐药中的作用
PGC1β和UBQLN1蛋白表达：索拉非尼耐药肿瘤中PGC1β表达显著降低，与体外结果一致。体外耐索拉非尼HCC 细胞和体内肿瘤中检测到 UBQLN1 水平升高。据研究发现，UBQLN1 与底物蛋白结合，并将底物穿梭至19s 蛋白酶体，从而协助蛋白酶体降解。作者推测是否 PGC1β 受 UBQLN1 调节。
PGC1β和UBQLN1相互作用：共聚焦显微镜和免疫沉淀检测证明了 UBQLN1 和 PGC1β 的共定位，以及它们之间的直接相互作用。此外，UBQLN1的过表达导致PGC1β下调，而沉默UBQLN1导致PGC1β上调。UBQLN1 的过表达加速了亲代 HCC 细胞中 PGC1β 的降解，UBQLN1 对 PGC1β 的影响可以通过 MG132 处理消除，表明UBQLN1 通过蛋白酶体介导的降解调节 PGC1β。
泛素化水平：UBQLN1 过表达后 PGC1β 的泛素化保持不变，表明 UBQLN1 以不依赖泛素化的方式促进 PGC1β 与蛋白酶体之间的相互作用，从而加速其对 PGC1β 的蛋白水解。
线粒体生物发生和ROS生成：UBQLN1的过表达导致ROS水平降低，PGC1β过表达可在一定程度上恢复。此外，UBQLN1 的过表达还降低了索拉非尼处理的亲代细胞中的 TFAM mRNA 水平，而PGC1β过表达可以部分恢复TFAM的减少。以上表明UBQLN1 以 PGC1β 依赖方式抑制线粒体生物发生和 ROS 生成。
索拉非尼耐药性的机制
为了验证 UBQLN1 在临床 HCC 患者中的作用，该研究招募了 78 名具有完整预后信息的 HCC 患者，根据UBQLN1水平将患者分为两组。生存分析表明，UBQLN1 高表达与较差的无复发生存率（RFS）显著相关，而且其总体生存率更差（OS）。
为了进一步验证 UBQLN1 在体内的作用，建立了耐索拉非尼皮下 CDX 模型。动物级 siRNA 和慢病毒用于抑制UBQLN1 表达。与体外结果一致，与对照组相比，具有较低 UBQLN1 水平的 HepG2 和 HCCLM3 异种移植体对索拉非尼治疗恢复敏感。
该研究通过基于质谱的蛋白组学等技术手段，发现了一种索拉非尼耐药中线粒体生物发生和 ROS 稳态的新机制，这可能为肝细胞癌（HCC）患者提供新的治疗靶点和策略。
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参考文献
Xu J, Ji L, Ruan Y, Wan Z, Lin Z, Xia S, Tao L, Zheng J, Cai L, Wang Y, Liang X, Cai X. UBQLN1 mediates sorafenib resistance through regulating mitochondrial biogenesis and ROS homeostasis by targeting PGC1β in hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 18;6(1):190.
拜谱生物：
