修饰种类 | 应用方向（表型） | 生物学过程 |
磷酸化（S/T） | 所有胁迫（包括生物和非生物胁迫） | 信号转导、细胞周期、生长发育以及癌症机理等 |
磷酸化（Y） | 是癌症细胞转变过程中的主要信号，目前已知的致癌基因有3/4是酪氨酸激酶基因。 | 许多先天遗传病和后天疾病的一个关键步骤。 |
细胞分裂素是调节植物发育、生长和胁迫应答的植物激素，尤其是在植物对高盐度的适应中起负调节作用。然而，阻碍细胞分裂素信号传导并实现耐盐性的分子机制尚不完全清楚。
2021年8月17日，山东大学生命科学学院研究团队在EMBO reports（IF=8.807）期刊中发表一篇题为“MPK3/6-induced degradation of ARR1/10/12 promotes salt tolerance in Arabidopsis”的研究成果。该研究利用蛋白质组学技术探究了盐胁迫通过细胞分裂素信号组件——拟南芥反应调节因子（ARR）的磷酸化和降解抑制细胞分裂素信号的分子机制。拜谱生物提供了磷酸化修饰位点分析服务。
MPK3/6-induced degradation of ARR1/10/12promotes salt tolerance in Arabidopsis
MPK3/6诱导的ARR1/10/12降解促进拟南芥耐盐性
期刊：EMBO reports
影响因子：8.807
发表时间：2021年8月17日
作者单位：山东大学生命科学学院
技术方法：磷酸化修饰位点分析
盐胁迫是否影响ARR1/10/12蛋白水平？
Western blot：盐处理后ARR1 /10/12蛋白水平呈时间依赖性下降
盐胁迫如何降低ARR1/10/12蛋白水平？
酵母双杂交：MPK3/6与ARR12相互作用，而与ARR1/10没有相互作用；MPK4与ARR1/10/12不存在相互作用。
双分子荧光互补（BiFC）：ARR1/10/12-YFPC在拟南芥叶肉原生质体瞬时共表达MPK3/6-YFPN时，表现出强烈的黄色荧光蛋白(YFP)荧光，但在空载体对照或MPK4-YFPN转化的细胞中不存在。以上表明ARR1/10/12特异性与MPK3/6相互作用，而与MPK4不相互作用。
体内免疫共沉淀（CoIP）：在拟南芥原生质体中，MPK3/6-YFP可以与ARR1/ 10/12-MYC免疫共沉淀，而MPK4-YFP不行。
总之，这些结果表明，ARR1/10/12与MPK3/6相互作用。
已知MPK3/6可被盐胁迫激活，而上述研究又证明其与ARR1/10/12相互作用，那么盐胁迫是否触发MPK3/6介导的ARR1/10/12磷酸化？
体外磷酸化试验：在MKK5DD存在下，ARR1/10/12被MPK3/6特异性直接磷酸化，MKK5DD是MKK5激活MPK3/6的组成性活性形式。
ARR1/10/12中可能存在的MPK3/6磷酸化位点？
磷酸化蛋白质组学：采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）对MPK3/6体外磷酸化的ARR1/10/12-His重组蛋白进行了分析。LC-MS/MS分析发现ARR1中的Thr553是MPK6的磷酸化位点。ARR1中的Thr552或Thr553作为MPK3的候选磷酸化位点，因为检测到一个带有磷酸化修饰的y11碎片离子（TTPSYDMFTTR），所以无法准确区分Thr552和Thr553之间的磷酸化位点。ARR12中的Ser322或Ser323作为MPK6候选磷酸化位点。然而，在ARR10中没有发现MPK3或MPK6的磷酸化位点，在ARR12中也没有发现MPK3的磷酸化位点，LC-MS/MS分析没有检测到相应的肽段。此外，该研究分析了ARR1 /10/12的氨基酸序列，基于生物信息学预测（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw）和以前的报道，发现ARR1中有两个潜在的MPK磷酸化位点（Thr277, Thr553），ARR10中有三个潜在的MPK磷酸化位点（Ser356, Ser383, Ser426），以及ARR12中5个MPK磷酸化潜在位点（Thr312, Ser323, Thr419, Ser462, Ser426）。
通过体外磷酸化检测确定修饰位点，T553是ARR1中MPK3/6磷酸化的主要残基，S383是ARR10中MPK3/6磷酸化的主要残基，S323是ARR12中MPK3/6磷酸化的主要残基。
最后结合体内磷酸化试验，证明在盐胁迫下MPK3/6直接磷酸化ARR1/10/12。
依赖MPK3/6的ARR1/10/12磷酸化是否与其蛋白水平降低有关？
免疫印迹和蛋白定量：盐胁迫导致野生型的ARR1/10/12蛋白呈时间依赖性逐渐降低，但在MPK3SR/MPK6SR突变幼苗中没有降低。因此，MPK3/6活性是盐诱导的ARR1/10/12蛋白水平下降所必需的。
ARR1/10/12降解是否需要磷酸化？
免疫印迹和蛋白定量：与正常的ARR1/10/12不同，在盐胁迫下，ARR1T553A、ARR10S383A和arr12s323a保持稳定，表明在盐胁迫下，MPK3 /6介导的ARR1/10/12磷酸化促进ARR1/10/12蛋白降解。
MPK3/6介导的ARR1/10/12磷酸化在盐胁迫反应中的生物学意义？
植株表型、根长、存活率和鲜重：比较野生型、ARR1/10/12过表达、ARR1/10/12非磷酸化形式和ARR1 /10/12磷酸模拟形式。结果表明，MPK3/6介导的ARR1/10/12磷酸化降低了ARR1/10/12蛋白抑制耐盐性的能力。
综上所述，盐胁迫导致MPK3 /6促进ARR1/10/12蛋白磷酸化和降解/不稳定。
MPK3/6和ARR1/10/12在响应盐胁迫中的作用关系？
植株表型、根长、存活率和鲜重：构建MPK3SRar1/12四倍突变体。4个指标结果显示，MPK3S突变体的超敏感盐响应在ARR1 /12背景下得到了高度缓解。以上表明，MPK3/6作用于ARR1/10/12的上游，促进植物对高盐度的适应。
在正常生长条件下，MPK3/6活性较低，而ARR1/10/12维持最适细胞分裂素响应，以控制植物的生长发育。植物暴露在高盐环境中会激活MPK3/6，使ARR1/10/12磷酸化和不稳定，最终抑制细胞分裂素响应，导致生长抑制。
耐盐性的模型：盐胁迫激活MKK5-MPK3/6-ARR1/10/12信号模块
拜谱生物磷酸化产品：苏氨酸/丝氨酸/酪氨酸修饰位点
| 磷酸化修饰种类 | 技术特点 |
1 | TMT (广谱磷酸化位点:Thr\Ser) | 采用TiO2/IMAC/酪氨酸磷酸化基序抗体富集磷酸化肽段，特异性高。 采用高通量高分辨质谱检测。 |
2 | Label free (广谱磷酸化位点：Thr\Ser) |
3 | Label free (特异磷酸化位点：Tyr)
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