帕金森病（PD）是第二大神经退行性疾病，是一种与囊泡运输功能障碍和神经递质分泌有关的衰老疾病。PD 的经典病理特征是黑质致密部 (SNpc) 中多巴胺能神经元的渐进性损伤和丧失，以及路易小体和路易神经突的形成，分泌颗粒（SG）是在多巴胺能神经元中合成神经肽和激素的致密核心囊泡。目前，SGs 损伤与 PD 的关系尚不清楚。
8月21日，中国医科大学法医学学院研究团队发表了一篇题为“Proteomic characterization of secretory granules in dopaminergic neurons indicates chromogranin/secretogranin-mediated protein processing impairment in Parkinson’s disease”的文章，该研究提供了帕金森疾病的 SG 蛋白质图谱，并依此阐明了SGs的运输和分泌功能障碍在帕金森病理中的分子机制。
多巴胺能神经元分泌颗粒（SG）的蛋白质组学特征揭示了帕金森病存在嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白介导的蛋白生成障碍
期刊：Aging-US
影响因子：5.682
发表时间：2021.8.21
作者单位：中国医科大学法医学学院
样本类型：亚细胞结构
检测方法：label free定量蛋白质组学
PD:帕金森病、SG：分泌颗粒
采用MPTP（1-甲基-4-苯基- 1,2,3,6 -四氢吡啶）诱导帕金森疾病小鼠模型。
酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化实验：
与对照组相比，MPTP连续处理5天就会显著减少黑质（SN）和纹状体（CPU）中多巴胺能神经元的数量，说明MPTP 处理后多巴胺能神经元存在损伤和丢失，模型构建成功。
免疫印迹实验：
在 PD 小鼠模型的 SN 和 CPU 区域都观察到 Scg3 水平显著降低，Scg3 被认为是 SG 的标志蛋白。相比之下，Scg2 的水平保持不变。此外，作者发现Scg3在SN中的减少幅度大于CPU。
上述结果表明，在 MPTP 诱导的 PD 模型中，SN 和 CPU 的Scg3 表达都存在降低，表明在多巴胺能神经元损伤中 SGs 可能受损。
SN和CPU的多巴胺能神经元数量和分泌颗粒蛋白（Scg）水平
双重免疫染色实验：
Scg2 和 Scg3 都在黑质（SN）中高度表达，包括黑质致密部(SNpc)和黑质网状部(SNr)。与 Scg2 相比，Scg3 分布得更全面。在腹侧被盖区 (VTA) 和 SNpc 的多巴胺能神经元中，观察到大量红色颗粒，这些红色颗粒是由两种分泌颗粒蛋白抗体标记的。
荧光强度量化表达&相关性量化共定位：
分析两种分泌颗粒蛋白和TH之间的重叠相关性。结果显示，Scg2 与 TH 之间存在很强的相关性（VTA：0.70；SNpc：0.62），而 Scg3 与 TH 之间存在中等相关性（VTA：0.50；SNpc：0.45）。而且，VTA中的共定位指数均高于SNpc。
然而，根据荧光强度，在受到 MPTP 损伤后，VTA 和 SNpc 的多巴胺能神经元中 Scg2 和 Scg3 的表达均显著降低。此外，与VTA相比，在SNpc的多巴胺能神经元中，分泌颗粒蛋白和 TH 的相关性下降的更显著。Scg3 比 Scg2 下降更显著。
上述结果与免疫印迹基本一致，表明PD 小鼠模型中分泌颗粒（SG）减少，尤其是黑质致密部（SNpc）的多巴胺能神经元中的SG。此外，也表明SG可能更容易受到SNpc多巴胺能神经元损伤的影响。
Scg2或Scg3的双重免疫荧光染色
为了解帕金森病中SGs损伤的分子机制，采用MPP+（1-甲基-4-苯基吡啶）诱导多巴胺能SH-sy5Y细胞，建立高剂量急性（acute）和低剂量轻度（mild）模型。
细胞活力测定：
高剂量处理的细胞活力呈浓度依赖性降低，处理48小时细胞严重损伤；低剂量处理24小时对细胞活力几乎没有影响。
细胞样品免疫印迹实验：
mild和acute处理，都导致细胞模型中Scg3显著降低，Scg2无显著变化。与上述小鼠模型的体内结果一致。
培养基分泌物免疫印迹实验：
Scg2 在 SH-sy5Y 细胞培养基中几乎没有分泌。相比对照组，acute和mild的Scg3 略有上升。
上述结果说明，MPP +处理后分泌颗粒蛋白（Scg）下调表达，特别是 SH-sy5Y 细胞中的 Scg3，进一步说明帕金森病细胞模型的多巴胺能神经元中分泌颗粒（SG）受损。
SH-Sy5Y细胞活力和Scg表达变化
在GO亚细胞定位分析(cell component, CC)中，“分泌颗粒(secretory granules, GO: 0030141)”被高度富集，有56 个差异蛋白注释到“分泌颗粒”。
RT-PCR验证56个蛋白的mRNA水平：
大多数mRNA与质谱检测的蛋白水平变化一致，除了DBH，MTMR2，和THBS1，可能是由于蛋白翻译过程中的转录后调控所致。
RT-PCR验证蛋白质组学结果可靠性
GO分析56个蛋白：
大部分蛋白富集在生物转运过程，其次是在细胞定位、细胞活化和白细胞介导的免疫。此外，许多生物过程在MPP +处理组中被抑制，尤其是囊泡介导的转运。
KEGG分析56个蛋白：
与总差异蛋白的富集结果一致，溶酶体和吞噬体功能以及脂质代谢在很大程度上受到损害。这些通路主要包括AP1M1、NEU1、PPT1和THBS1、RAC1、MAPK1和ACAA1、PPT1。
PPI网络分析56个蛋白：
基于STRING数据库和Cytoscape软件，分析蛋白-蛋白互作（PPI）网络关系。值得注意的是，标志蛋白 Scg2 和 Scg3 与嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白家族 CgA (CHGA) 和 CgB (CHGB) 两个成员聚集在一起，他们在SGs 中肽神经递质的聚集和加工中起着重要作用。
上述结果表明，几种 SGs 蛋白失调，尤其是嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白，这可能导致帕金森病细胞模型发生病变。
56个“分泌颗粒”差异蛋白的功能分析
SGs 在调节分泌途径的多种分泌蛋白释放中起着关键作用。通过亚细胞定位分析，作者整理出140个“分泌蛋白”，包括“胞外...”蛋白，并与56个蛋白进行整合分析。
KEGG通路分析140+56个蛋白：
主要聚集在粘附连接、内吞、糖酵解和糖异生以及Rap1信号通路中。
PPI网络分析140+56个蛋白：
确定了几种候选分泌蛋白和肽，它们参与分泌粒蛋白相关模块、神经分泌蛋白 VGF、神经肽 Y (NPY)、载脂蛋白 E (APOE) 和前强啡肽 (PDYN) 的相互作用。
RT-PCR验证候选蛋白和Scg3相关蛋白的mRNA水平：
除了前脑啡肽-B (PDYN)，所有蛋白质都显示出下调。
以上结果表明，分泌颗粒的功能受损可能导致帕金森病细胞模型中分泌蛋白的加工和运输产生障碍。
56个“分泌颗粒蛋白”+140个“分泌蛋白”的功能分析
目前在多种神经退行性疾病中均发现分泌颗粒（SG）异常，包括阿尔茨海默病，而帕金森病中的SG损伤机制尚不清楚，该研究构建了帕金森病细胞模型，并对亚细胞结构——SG进行了蛋白质组学检测与分析，为了解帕金森病的蛋白特征和分子机制提供基础。
参考文献
Wen G, Pang H, Wu X, Jiang E, Zhang X, Zhan X. Proteomic characterization of secretory granules in dopaminergic neurons indicates chromogranin/secretogranin-mediated protein processing impairment in Parkinson's disease. Aging (Albany NY). 2021 Aug 21;13(undefined). doi: 10.18632/aging.203415. Epub ahead of print. PMID: 34420933.
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