如何做代谢组学?注释、定量和最佳报告实践的指南
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简述

如何做代谢组学?注释、定量和最佳报告实践的指南

基于质谱的代谢组学方法可以对成千上万种代谢物的峰图同时进行定性和定量。然而,化学成分的复杂性和代谢组的动态变化使得化合物的鉴定和可靠的定量变得非常复杂。混合物中许多代谢物的同时定量还可能因为离子抑制、碎片化和异构体的存在而变得更为复杂。在此,作者提出了涵盖样品制备、重复和随机化、定量、回收和重组、离子抑制和峰值错误识别的指南,作为一种手段,使基于液相色谱/气相-质谱技术的代谢组学测定的数据得到高质量的报告。



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1.  采样、淬灭、代谢物提取和保存‍

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     代谢组学工作流程中的第一步(也是特别重要的一步)是快速停止或淬灭代谢反应并以某种方式提取代谢物,使其产生稳定的提取物。
采样和淬灭:

淬灭最重要的是要快速;这在细胞和组织等代谢高度活跃的系统中尤为重要,但在血清、血浆或尿液样本等生物体液中则不那么重要;对于细胞而言,需要快速的离心获得沉淀,组织样品需要快速切除,液氮速冻,-80℃恒温保存。大组织样则需要冷冻夹持的方法;如组织样本不好提取代谢物,如植物样本,应先研磨后提取;

代谢物提取和保存:

通常需要通过多次洗涤步骤去除生长介质,以减少离子抑制的影响,由于与代谢物分析仪器不兼容,用于初始萃取的溶剂可能需要交换。

样品保存:

1)挥发性成分不适于冷冻干燥;

2)尽可能短完全干燥的样品的保存时间;

3)样品解冻过程中务必确保新陈代谢的淬灭。

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2、样品重复和随机化

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重复分为技术重复和生物学重复。技术重复可以全面地评估数据的实验技术差异性。而生物学重复必须≥4,并且应当以高度统一的方式获取重复样本。对于是否需要技术重复来支持生物学重复,其很大程度取决于变异的相对程度。使用新系统时,试点实验是最好的用于评估生物学和技术变异的实验,从而确定合适的样本数量和重复数量以实现统计的可靠性。
样本上机的随机化也是同样重要的。非随机化的上机测定可能因样本处理时间和仪器性能的变化而掩盖了组间的生物学变化,甚至造成人为的差异。
此外,质量控制样本和批量校正是实验必不可少的,这种实验控制有助于监测仪器的性能和稳定性,从而提高数据质量。


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3、定量

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首先确保感兴趣的代谢物都在线性检测范围内;
相对定量:代谢组学数据通常以相对定量的形式提供,相对值是表达未注释分析物水平和变化的唯一方法,但是代表不同化合物的LC-MSGC-MS峰的相对强度与代谢物的绝对浓度不直接相关,这是由于在一个复杂的混合物中不同代谢物的电离效率不同;
绝对定量:标准曲线的建立可以解决相对定量这一问题,在确定酶结合位点占有率、代谢反应的热力学和通过代谢网络流动的分子动力学需要用到绝对值。


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4、回收和重组实验

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回收实验即在最初的提取溶剂中加入经验证的标准品,以评估在提取、保存和处理过程中代谢物的损失。而对于未知的分析物,加入可用标准成分在本质上是不可能的,而提取重组是一种有效的替代方法。在这种方法中,通过与充分表征的参照物(大肠杆菌拟南芥或人类生物液体)的结合来表征一种新的组织。
代谢组学的研究中,某些代谢物的回收率很差。70%-130%的回收率是可接受的,任何超出此范围的代谢物,其量化都应进一步测定。例如,即使是50%的回收率(如果可重现且线性)也是可以被认为是可接受的。


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5、离子抑制

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离子抑制是LC-MS的普遍问题,由于基质效应会影响共流分析物的电离,影响定量的精确性和准确性,低丰度的代谢物将无法检测到。
离子抑制问题没有普遍的解决办法,但可以评估离子抑制的效果。减少化离子抑制的几种策略:1、改进样品的制备和色谱选择性;2、采用合适的吸收剂进行固相萃取(SPE)3、仔细选择离子源和柱极性。例如,大气压化学电离比电喷雾电离更不易产生基质效应。


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6、峰值错误识别

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高分辨率MS可能不足以分离某些异构体(相同分子式但结构不同的化合物)。为提高分离效果,可采用反向离子对色谱、亲水作用色谱,或者在色谱进样前进行化学衍生化。其次,重叠化合物的存在可能会阻止某些代谢物的检出。而源内降解产物(ESI的副产物离子)也是导致峰错误识别的关键因素。源内降解将降低代谢物母离子的强度,由此产生的碎片离子可能会混淆其他共流化合物的分析。
峰过滤对于后续的统计分析十分重要。代谢组学数据包含了很大比例的无特征信息峰,需要采用多功能和数据自适应的方法过滤数据。

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7、报告透明度

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代谢组学实验方法的必要组成部分如Box 1

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出版物往往缺乏对样品制备和分析程序的详细叙述。鉴于期刊的字数限制和学术报告高度简洁的特性,补充数据对结果进行高度详细的叙述是十分必要的。MetaboLightsand the Metabolomics Workbench等数据库正是用于此目的。此外,作者提出以补充表1(有关代谢物数据的简单问题列表)和补充表2GC-MSLC-MS实验的代谢物注释的建议)作为代谢组学报告的附加内容。


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总结

如何做代谢组学?注释、定量和最佳报告实践的指南

作者提出了提高代谢组学数据集质量和跨实验室可比性的建议。这些建议包括从采样、代谢物提取、量化和峰识别到测量和报告透明度的指南,为此建议采用以数据为中心的方法,而不是以色谱图为中心的方法。


作者提出的建议将提供几个优势:

(1)阅读报告的原始数据将使读者能够评估报告数据的质量,因此,对得出的结论更有信心;

(2)研究人员将有一个简单的途径来获取他们自己实验的关键信息;

(3)多个实验室获得的数据可以更容易地进行比较。

作者强调的是,本文提出的建议旨在鼓励更全面、更准确地报道代谢物注释及其各自的量化。提议的报告标准并不是要直接替代代谢组库设定的标准。事实上,在大多数情况下,这些是完全互补的。作者建议代谢组学从业者遵循本文在此讨论的标准库标准。

我们相信,更广泛地采用这些建议将提高代谢组数据的报告质量,推动大家努力改进代谢组的注释,并最终促进来自不同实验室的代谢物数据的交流和可比性。‍



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