聚焦蛋白质组更新(Proteome Turnover)丨方法、应用、观点

导言:哥伦比亚大学生物科学系的Alison Barbara Ross,近期在Mol Cell Proteomics发表了一篇综述,作者重点介绍了设计蛋白质组更新实验的重要内容,有关蛋白质组更新守恒原则的关键生物学发现,以及技术和生物学研究的未来前景。


该综述的题目为“Proteome Turnover in the Spotlight: Approaches, Applications, and Perspectives”,在线发表于2020年12月7日。


聚焦蛋白质组更新(Proteome Turnover)丨方法、应用、观点            


聚焦蛋白质组更新(Proteome Turnover)丨方法、应用、观点             

图解摘要

    在所有细胞中,蛋白质不断合成和降解,以维持蛋白质体内稳态并响应刺激而改变基因表达水平。蛋白质合成和降解的过程统称为蛋白质更新。在稳定状态下,蛋白质更新是恒定的,以维持蛋白质稳态,但在动态响应中,蛋白质会改变其合成和降解速率,以根据内部或外部刺激调节蛋白质组。因此,探究蛋白质更新的动力学有助于深入了解细胞如何调节必需生物学过程,例如生长,分化和应激反应。


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图解说明了蛋白质更新参数之间的相关性和相互关系

     在这里,作者概述了检测蛋白质更新动力学的历史和当前方法,这些方法是基于稳态和动态系统中蛋白质组水平的,重点是使用稳定的同位素标记氨基酸进行代谢追踪。


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一、放射性,药物和荧光

    在过去,最常用的方法是基于放射性同位素碳、氢或硫的氨基酸。然而,这些分析受限于所需相对较高的放射性剂量(及其对细胞和动物健康的影响),样品制备过程中蛋白质的大量损失以及对显示微分合成或衰变动力学的候选蛋白质的鉴定具有挑战性。随后,生物化学工具的应用,例如合成或降解的小分子抑制剂以及基因工程蛋白的发明,使人们对蛋白质组稳态和更新速率有了新见解。尽管这些工具提供可有价值的新见解,但它们同样有相当大的局限性。首先,蛋白质合成或降解的抑制(例如,通过药物)可能导致代偿性和脱靶效应,这可能使确定生理更新速率具有挑战性。其次,蛋白质标签可能会损害生理蛋白质功能和半衰期,尤其是小蛋白和膜蛋白。第三,标记蛋白质构建体的大型文库的构建既耗时又耗费资源。尽管如此,这些方法仍被广泛使用,特别是在专门研究蛋白质合成或降解的靶向研究中。


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二、Dynamic SILAC法‍

      21世纪初期,使用非放射性同位素和质谱相结合的方法在蛋白组更新研究中变得普遍。但是,通过代谢途径掺入重同位素通常会导致重标记氨基酸掺入蛋白质的程度发生变化,从而通常无法实现完全标记。通过在培养基或食物来源中添加可确定和选择的稳定同位素的氨基酸,在很大程度上克服了这一问题。这些“重”氨基酸最初用于定量研究,作为细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture[SILAC])的一部分,其中未标记和完全标记的样品中蛋白质组丰度差异进行比较。


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动态SILAC工作流程

      重氨基酸标记肽信号速率主要对应于该肽的合成速率,而含轻氨基酸的肽减少的速率代表其降解速率。因此,重肽信号与轻肽信号之比直接反映了蛋白质更新。

      动态SILAC方法为深入了解不同细胞,组织和疾病中蛋白质稳态的细胞机制提供了宝贵的帮助,并且可以帮助阐明细胞分化,应激并执行其基本功能的机制。


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蛋白质更新速率的决定因素


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三、确定定量和差异蛋白质组更新数据的方法

     理想情况下,蛋白质组更新和蛋白质半衰期的定量分析应分别包括蛋白质合成和降解速率的数据。而常规的动态SILAC实验,分离这两个过程的数据是困难的,因为样品制备和LC-MS / MS数据采集的实验变异性。已经有几种方法专门确定单独的合成和降解速率。一种方法是在动态SILAC实验中添加内标(3-channel SILAC),这是Lamond小组在2012年首次使用的方法,这个方法最适合表征这些速率的动态变化;第二种策略是将动态SILAC与等重标记相结合(SILAC-TMT)。这些方法增加了试剂成本,并且需要归一化


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四、使用亲和纯化的人工氨基酸

     使用仅脉冲SILAC实验检测低丰度、新合成蛋白质的困难在有丝分裂后细胞中尤为突出。为了克服这些困难,SchumanTirell实验室开发了生物正交非标准氨基酸标签(BONCAT)。最近还将组合的pSILACBONCAT标记与TMT标记相结合,还提供了样品多路复用的优势,这些研究使用叠氮高丙氨酸(AHA)标记。


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五、整合多组学结果

     上面提出了基于示踪剂的方法,可以在稳态和动态条件下直接测量蛋白质更新参数。一种潜在的替代方法是使用RNA水平,蛋白质水平以及核糖体密度的多组学方法,可以将它们一起分析以估算蛋白质的合成和降解速率。由于稳态蛋白质组学测量绝对蛋白困难,这些方法对动态表达的数据效果最好,可以在RNA和蛋白水平非常精确地测量相对变化。由于用于捕获数据的工具及其生成格式的差异,多组学数据的集成长期以来一直是一个主要挑战。然而,在过去的几年里,多重计算工具已经被开发,如PECAplus

     这些新颖的组合方法可用于回答有关蛋白质组更新及其调节的一些悬而未决的问题。作者预测,对全蛋白组水平的蛋白更新速率进行分类的类似工作非常值得投资,因为它们将对驱动蛋白质表达的这些基本过程的基本原理提供独特的补充信息。


  参考文献:Alison Barbara Ross et al., 2020, Proteome Turnover in the Spotlight: Approaches, Applications, and Perspectives (Mol Cell Proteomics, Q1, 4.87)


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