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项目文章 |姥鲛烷促进厌氧糖酵解,促进巨噬细胞的促炎症激活和关节炎的发展

姥鲛烷促进厌氧糖酵解,促进巨噬细胞的促炎症激活和关节炎的发展

Pristane promotes anaerobic glycolysis to facilitate proinflammatory

activation of macrophages and development of arthritis 

研究对象:大鼠的脾巨噬细胞

样本类型:脾巨噬细胞

组别设置:对照组control (DA-C, n = 4) 和姥鲛烷处理组PIA (DA-P, n = 4)

研究方法:Label free蛋白质组学

期刊:Experimental Cell Research

影响因子:3.383


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姥鲛烷引起的关节炎(PIA)在大鼠中可以通过脾的T细胞过继转移,先天的免疫反应在T细胞激活中扮演着关键的作用,然而,在临床的初始阶段,巨噬细胞等初始细胞的激活机制仍然是不清楚的。西安交通大学的研究团队发现PIA依赖于巨噬细胞,因为细胞衰竭减轻了疾病的严重程度,PIA大鼠的脾巨噬细胞显示出M1表型转化,定量蛋白质组学分析表明姥鲛烷会引起巨噬细胞的代谢重编程,有氧氧化向糖酵解的转化。值得注意的是,姥鲛烷处理巨噬细胞表明线粒体失调,糖酵解流量和酶活性增加,除此之外,TNFα的产生与糖酵解酶Ldha/Ldhb密切相关,当糖酵解被抑制时TNFα的产生会减少,而柠檬酸循环被阻断时TNFα的产生会增加,其研究成果发表在2021年1月1日的Experimental Cell Research杂志上(IF=3.383)。







研究思路




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研究结果




1. M1巨噬细胞与PIA的发展有关



  • DA大鼠的PIA模型通过单次注射姥鲛烷来进行建立,大鼠的巨噬细胞提前一天通过注射GdCl3来进行去除 (Fig. 1A),通过流式细胞仪检测到的减弱效应表明血液中ED1+细胞的比例在注射GdCl3后的第三天减弱了60% (Fig. 1B),与对照PIA大鼠相比,巨噬细胞减弱后注射姥鲛烷引起的关节炎症状的减轻,关节炎得分(Max.score)降低表明巨噬细胞在关节炎发展中的关键作用(Fig. 1C and D)

  • 巨噬细胞的极化作用是解决炎症不可或缺的过程,为了探索姥鲛烷是否能影响巨噬细胞的极化,通过流式细胞仪分析了姥鲛烷处理12天后脾巨噬细胞中肿瘤坏死因子TNFαM1标志物)和MRC1M2标志物)的表达。结果表明ED1+细胞的百分比在PIA处理大鼠中是明显高于对照组的(Fig. 1E)。脾ED1+细胞TNFα细胞的百分比和MFIPIA处理后是显著增加的,然而,MRC1+细胞没有差异(Fig. 1F and G),这些结果表明PIA处理的大鼠脾巨噬细胞向M1表型转移,可能发挥着促炎症的作用,同时,检测了PIA处理1224天的脾巨噬细胞中TnfaMrc1的基因表达,Tnfa的表达水平增加,而Mrc1的表达水平下降,这也表明脾巨噬细胞向着M1表型转化(Fig. 1H)

  • 除此之外,体外大鼠巨噬细胞系NR8383使用姥鲛烷处理,来确认体内巨噬细胞极化的发现,NR8383细胞表现出TnfaIl1b表达的显著增加,和Mrc1表达的显著减少,结果表明脾巨噬细胞转化为M1表型可能与关节炎的发展是相关的。

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姥鲛烷处理巨噬细胞,向M1表型转化,在关节炎的发展中发挥着关键作用




2.定量蛋白质组学研究了PIA大鼠和对照组脾巨噬细胞的功能差异



为了揭示姥鲛烷调节巨噬细胞极化的潜在机制,对DA大鼠使用PBS(DA-C)或姥鲛烷(DA-P)注射处理,取其脾巨噬细胞进行定量蛋白质组学分析。


  • 一共鉴定到4528个蛋白质,使用PLS-DA分析不同组学蛋白的差异性,结果表明,DA-C  DA-P可以清楚地划分为两个类别(Fig. 2C),一共有861个差异表达的蛋白质;

  • GO注释表明,生物学过程分析表明差异蛋白主要分布于细胞代谢过程,合成过程和细胞成分组装(Fig. 2D),最主要的细胞组成类别是胞内器官,细胞质,胞外膜结合细胞器和胞内核糖核蛋白复合物,分子功能中最重要的类别是核酸结合,酶结合和蛋白复合物结合;

  • KEGG富集分析表明,主要富集的路径是代谢过程,基因信息过程,细胞过程和有机系统(Fig. 2E),总之,这些结果表明姥鲛烷处理大鼠后,脾巨噬细胞存下明显的代谢紊乱。


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对照和PIA处理大鼠的定量蛋白质组学分析

 



3.姥鲛烷刺激的巨噬细胞的代谢模式发生了变化



  • 为了得到巨噬细胞更加详尽的代谢过程,依赖于定量蛋白质组学数据分析了糖酵解和柠檬酸循环,热图表明在姥鲛烷处理后糖酵解途径的许多酶呈现出增加的趋势,特别是乙醇脱氢酶(Akr1a1),乙醛脱氢酶(Aldh2),己糖激酶(Hk3)ATP依赖型6-磷酸果糖激酶(Pfkl)表现出显著的增加(Fig. 3AB),乳酸脱氢酶是糖酵解路径中最重要的酶之一,有两个主要的亚基,LDH-ALDA-BLDH-A催化丙酮酸转化为乳酸,LDH-B催化乳酸转化为丙酮酸,发现LDH-A的表达没有变化,LDH-B的表达显著下调(Fig. 3C)

  • 与糖酵解路径中酶的表达相反,氧化磷酸化路径中许多酶的表达是减少的,比如二氢硫辛酸脱氢酶(Dld),丙酮酸脱氢酶(Pdhb),琥珀酰辅酶A连接酶β亚基(Sucla2)( Fig. 3DE),这些结果表明厌氧糖酵解是增加的,然而有氧氧化是被抑制的(Fig. 3F)


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姥鲛烷引起大鼠巨噬细胞无氧糖酵解和有氧氧化的转换

 



4.姥鲛烷刺激引起巨噬细胞中线粒体失调



  • 由于线粒体位于代谢的中心位置,对姥鲛烷处理后的NR8383细胞的线粒体的一些指标进行检测,在姥鲛烷处理6 h后,巨噬细胞中线粒体的数目是减少的,LC3-GFP显示聚集,表明自噬(Fig. 4A)

  • JC-1聚集/单体检测表明姥鲛烷处理后线粒体膜是受损的(Fig. 4B),除此之外,姥鲛烷处理后会引起线粒体ROSMDA(脂质的过氧化产物)的增加(Fig. 4C and D),这表明姥鲛烷有损细胞的线粒体及其功能;

  • 胞内ATP的浓度是减少的,细胞内AMP/ATP是增加的,这也是线粒体数目减少的结果(Fig. 4E)


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姥鲛烷处理巨噬细胞引起线粒体代谢紊乱




5.姥鲛烷处理导致巨噬细胞的代谢向无氧糖酵解转变



  • 使用姥鲛烷体外刺激NR8383细胞系,来证实其对代谢重编程的影响,结果表明胞内L-乳酸的胞内浓度在姥鲛烷处理6 h后是显著增加的(Fig. 5A),在姥鲛烷处理6 h48 h,催化丙酮酸转化为乳酸的酶LDH的活性是显著增加的,然而催化乳酸转化为丙酮酸的酶LDH的活性是减少的(Fig. 5B C)

  • LDH的两个亚基,LDH-A  LDH-B能够组装成5种不同的四聚体同工酶,LDH1 LDH2LDH3LDH4LDH5NR8383巨噬细胞主要表达LDH5(包括4LDH-A亚基)和LDH4(包括3LDH-A亚基和1LDH-B亚基),LDH4相较于LDH5,更多催化乳酸生成丙酮酸。在姥鲛烷处理12h后,LDH5的蛋白水平没有变化,LDH4的蛋白水平明显减少,表明LDH-B的表达水平较低 (Fig. 5D),除此之外,NR8383细胞在姥鲛烷处理后,LdhamRNA表达水平增加(Fig. 5E),这些结果表明姥鲛烷处理导致LDH同工酶的转化,使细胞产乳酸的能力增加。此外,Ldha表达的增加可以被抑制自噬的PI3K抑制剂渥曼青霉素所抑制,这表明代谢调控可能是姥鲛烷增强自噬的最显著的影响(Fig. 5E)

  • 丙酮酸激酶PK是糖酵解过程的限速酶,通过检测丙酮酸的浓度测定其酶活性,PK活性在24 h是显著增加的(Fig. 5F)

  • 戊糖磷酸途径的6-磷酸-葡萄糖脱氢酶G6PD6-磷酸-葡糖酸脱氢酶6GPD的酶活性通过检测NADPH的数量进行确定,结果表明姥鲛烷的刺激减少了G6PD 6GPD的酶活性(Fig. 5G),这些结果均表明姥鲛烷转换巨噬细胞的代谢朝着无氧糖酵解路径,同时减弱柠檬酸循环和戊糖磷酸途径。

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姥鲛烷处理巨噬细胞引起糖酵解路径向乳酸转化,戊糖磷酸途径的酶活性减少

 



6.姥鲛烷处理后糖酵解的变化促进巨噬细胞向着M1表型转变



  • 为进一步确认关节炎中糖酵解和巨噬细胞极化的关系,检测PIA处理大鼠脾巨噬细胞Ldha/bmRNA表达比值。Ldha/b是增加的,表明糖酵解的水平是显著增加的,同时Ldha/bTnfa的增加有很强的相关性(Fig. 6AB)

  • 为了确定糖酵解是否会影响促巨噬细胞炎症的能力,使用姥鲛烷刺激NR8383细胞,并同时加入2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG),糖酵解的抑制剂,不同浓度的2-DG能够显著减弱姥鲛烷引起的Tnfa的表达(Fig. 6C)

  • 由于柠檬酸循环在这个过程发生了显著的变化,姥鲛烷处理的NR8383细胞中分别加入丙二酸(MA)3-硝基丙酸(3-NA),它们是柠檬酸循环中琥珀酸脱氢酶的两种抑制剂,与2-DG的作用相反,MA3-NA均能提高TNFα的表达(Fig. 6D)

 

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姥鲛烷引起的糖酵解作用的变化对于巨噬细胞TNFα的产生是必须的

 



7.结论



姥鲛烷刺激巨噬细胞的线粒体损伤,增强细胞的厌氧糖酵解,导致促炎症的激活,最终引起了关节炎(Fig. 7)


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