姥鲛烷促进厌氧糖酵解，促进巨噬细胞的促炎症激活和关节炎的发展

Pristane promotes anaerobic glycolysis to facilitate proinflammatory

activation of macrophages and development of arthritis 

研究对象：大鼠的脾巨噬细胞

样本类型：脾巨噬细胞

组别设置：对照组control (DA-C, n = 4) 和姥鲛烷处理组PIA (DA-P, n = 4)

研究方法：Label free蛋白质组学

期刊：Experimental Cell Research

影响因子：3.383

• DA大鼠的PIA模型通过单次注射姥鲛烷来进行建立，大鼠的巨噬细胞提前一天通过注射GdCl₃来进行去除 (Fig. 1A)，通过流式细胞仪检测到的减弱效应表明血液中ED1⁺细胞的比例在注射GdCl₃后的第三天减弱了60% (Fig. 1B)，与对照PIA大鼠相比，巨噬细胞减弱后注射姥鲛烷引起的关节炎症状的减轻，关节炎得分(Max.score)降低表明巨噬细胞在关节炎发展中的关键作用(Fig. 1C and D)；

• 巨噬细胞的极化作用是解决炎症不可或缺的过程，为了探索姥鲛烷是否能影响巨噬细胞的极化，通过流式细胞仪分析了姥鲛烷处理12天后脾巨噬细胞中肿瘤坏死因子TNFα（M1标志物）和MRC1（M2标志物）的表达。结果表明ED1⁺细胞的百分比在PIA处理大鼠中是明显高于对照组的(Fig. 1E)。脾ED1⁺细胞TNFα⁺ 细胞的百分比和MFI在PIA处理后是显著增加的，然而，MRC1⁺细胞没有差异(Fig. 1F and G)，这些结果表明PIA处理的大鼠脾巨噬细胞向M1表型转移，可能发挥着促炎症的作用，同时，检测了PIA处理12和24天的脾巨噬细胞中Tnfa和Mrc1的基因表达，Tnfa的表达水平增加，而Mrc1的表达水平下降，这也表明脾巨噬细胞向着M1表型转化(Fig. 1H)。

• 除此之外，体外大鼠巨噬细胞系NR8383使用姥鲛烷处理，来确认体内巨噬细胞极化的发现，NR8383细胞表现出Tnfa和Il1b表达的显著增加，和Mrc1表达的显著减少，结果表明脾巨噬细胞转化为M1表型可能与关节炎的发展是相关的。

图1 姥鲛烷处理巨噬细胞，向M1表型转化，在关节炎的发展中发挥着关键作用

为了揭示姥鲛烷调节巨噬细胞极化的潜在机制，对DA大鼠使用PBS(DA-C)或姥鲛烷(DA-P)注射处理，取其脾巨噬细胞进行定量蛋白质组学分析。

• 一共鉴定到4528个蛋白质，使用PLS-DA分析不同组学蛋白的差异性，结果表明，DA-C 和 DA-P可以清楚地划分为两个类别(Fig. 2C)，一共有861个差异表达的蛋白质；

• GO注释表明，生物学过程分析表明差异蛋白主要分布于细胞代谢过程，合成过程和细胞成分组装(Fig. 2D)，最主要的细胞组成类别是胞内器官，细胞质，胞外膜结合细胞器和胞内核糖核蛋白复合物，分子功能中最重要的类别是核酸结合，酶结合和蛋白复合物结合；

• KEGG富集分析表明，主要富集的路径是代谢过程，基因信息过程，细胞过程和有机系统(Fig. 2E)，总之，这些结果表明姥鲛烷处理大鼠后，脾巨噬细胞存下明显的代谢紊乱。

  
  

图2 对照和PIA处理大鼠的定量蛋白质组学分析

• 为了得到巨噬细胞更加详尽的代谢过程，依赖于定量蛋白质组学数据分析了糖酵解和柠檬酸循环，热图表明在姥鲛烷处理后糖酵解途径的许多酶呈现出增加的趋势，特别是乙醇脱氢酶(Akr1a1)，乙醛脱氢酶(Aldh2)，己糖激酶(Hk3)和ATP依赖型6-磷酸果糖激酶(Pfkl)表现出显著的增加(Fig. 3A和B)，乳酸脱氢酶是糖酵解路径中最重要的酶之一，有两个主要的亚基，LDH-A和LDA-B，LDH-A催化丙酮酸转化为乳酸，LDH-B催化乳酸转化为丙酮酸，发现LDH-A的表达没有变化，LDH-B的表达显著下调(Fig. 3C)；

• 与糖酵解路径中酶的表达相反，氧化磷酸化路径中许多酶的表达是减少的，比如二氢硫辛酸脱氢酶(Dld)，丙酮酸脱氢酶(Pdhb)，琥珀酰辅酶A连接酶β亚基(Sucla2)( Fig. 3D和E)，这些结果表明厌氧糖酵解是增加的，然而有氧氧化是被抑制的(Fig. 3F)。

图3 姥鲛烷引起大鼠巨噬细胞无氧糖酵解和有氧氧化的转换

• 由于线粒体位于代谢的中心位置，对姥鲛烷处理后的NR8383细胞的线粒体的一些指标进行检测，在姥鲛烷处理6 h后，巨噬细胞中线粒体的数目是减少的，LC3-GFP显示聚集，表明自噬(Fig. 4A)；

• JC-1聚集/单体检测表明姥鲛烷处理后线粒体膜是受损的(Fig. 4B)，除此之外，姥鲛烷处理后会引起线粒体ROS和MDA（脂质的过氧化产物）的增加(Fig. 4C and D)，这表明姥鲛烷有损细胞的线粒体及其功能；

• 胞内ATP的浓度是减少的，细胞内AMP/ATP是增加的，这也是线粒体数目减少的结果(Fig. 4E)。

  
  

图4 姥鲛烷处理巨噬细胞引起线粒体代谢紊乱

• 使用姥鲛烷体外刺激NR8383细胞系，来证实其对代谢重编程的影响，结果表明胞内L-乳酸的胞内浓度在姥鲛烷处理6 h后是显著增加的(Fig. 5A)，在姥鲛烷处理6 h到48 h，催化丙酮酸转化为乳酸的酶LDH的活性是显著增加的，然而催化乳酸转化为丙酮酸的酶LDH的活性是减少的(Fig. 5B 和C)；

• LDH的两个亚基，LDH-A 和 LDH-B能够组装成5种不同的四聚体同工酶，LDH1， LDH2，LDH3，LDH4和LDH5，NR8383巨噬细胞主要表达LDH5（包括4个LDH-A亚基）和LDH4（包括3个LDH-A亚基和1LDH-B亚基），LDH4相较于LDH5，更多催化乳酸生成丙酮酸。在姥鲛烷处理12h后，LDH5的蛋白水平没有变化，LDH4的蛋白水平明显减少，表明LDH-B的表达水平较低 (Fig. 5D)，除此之外，NR8383细胞在姥鲛烷处理后，Ldha的mRNA表达水平增加(Fig. 5E)，这些结果表明姥鲛烷处理导致LDH同工酶的转化，使细胞产乳酸的能力增加。此外，Ldha表达的增加可以被抑制自噬的PI3K抑制剂渥曼青霉素所抑制，这表明代谢调控可能是姥鲛烷增强自噬的最显著的影响(Fig. 5E)；

• 丙酮酸激酶PK是糖酵解过程的限速酶，通过检测丙酮酸的浓度测定其酶活性，PK活性在24 h是显著增加的(Fig. 5F)；

• 戊糖磷酸途径的6-磷酸-葡萄糖脱氢酶G6PD和6-磷酸-葡糖酸脱氢酶6GPD的酶活性通过检测NADPH的数量进行确定，结果表明姥鲛烷的刺激减少了G6PD 和6GPD的酶活性(Fig. 5G)，这些结果均表明姥鲛烷转换巨噬细胞的代谢朝着无氧糖酵解路径，同时减弱柠檬酸循环和戊糖磷酸途径。

图5 姥鲛烷处理巨噬细胞引起糖酵解路径向乳酸转化，戊糖磷酸途径的酶活性减少

• 为进一步确认关节炎中糖酵解和巨噬细胞极化的关系，检测PIA处理大鼠脾巨噬细胞Ldha/b的mRNA表达比值。Ldha/b是增加的，表明糖酵解的水平是显著增加的，同时Ldha/b和Tnfa的增加有很强的相关性(Fig. 6A和B)；

• 为了确定糖酵解是否会影响促巨噬细胞炎症的能力，使用姥鲛烷刺激NR8383细胞，并同时加入2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG），糖酵解的抑制剂，不同浓度的2-DG能够显著减弱姥鲛烷引起的Tnfa的表达(Fig. 6C)；

• 由于柠檬酸循环在这个过程发生了显著的变化，姥鲛烷处理的NR8383细胞中分别加入丙二酸(MA)和3-硝基丙酸(3-NA)，它们是柠檬酸循环中琥珀酸脱氢酶的两种抑制剂，与2-DG的作用相反，MA和3-NA均能提高TNFα的表达(Fig. 6D)。

图6 姥鲛烷引起的糖酵解作用的变化对于巨噬细胞TNFα的产生是必须的

姥鲛烷刺激巨噬细胞的线粒体损伤，增强细胞的厌氧糖酵解，导致促炎症的激活，最终引起了关节炎(Fig. 7)。