Exploring pathogenesis of primary biliary cholangitis by proteomics: A pilot study
蛋白质组学探索原发性胆管炎发病机理
合作单位：北京协和医院
期刊：World journal of Gastroenterology（3.3）
组学领域：Label Free
研究对象：人血清
原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种慢性进行性肝内胆汁淤积性疾病，可最终发展为严重的肝脏疾病，包括肝硬化、肝衰竭，甚至肝细胞癌。目前，PBC的发病机制尚不清楚。
血清自身抗体水平升高是自身免疫性疾病的特征。自身抗体的出现和波动不仅反映了疾病的状态，而且进一步加深了我们对疾病发病机制的认识。PBC的特异性诊断标志物抗线粒体抗体（AMA）参与了肝内胆管上皮细胞（iBECs）的损伤和破坏过程。
在这项试验研究中，作者旨在确定质谱方法作为探索新的PBC自身抗体的实验方法的可行性，并获得初步结果，以作为未来研究的指导。
技术路线
2014-2015年，招募18例年龄性别相符PBC病人，收集血浆。AMA通过免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验区分，9例AMA阳性，9例AMA阴性。
HiBECs（human intrahepatic biliary epithelial cells,人源肝内胆管上皮细胞），iBECs功能紊乱和丢失是PBC最重要的病理特征之一。
ProteinA/G捕获血液中的抗体（包括AMA），用protein A/G-抗体复合物在细胞中捕获相关的抗原。
实验结果
1.候选自身抗原的鉴定
共鉴定到1081个候选自身抗原，371个具有显著差异。线粒体相关的功能被高度富集，此外，参与B细胞活化、吞噬识别和吞噬的阳性调节的蛋白质也高度富集。
2.蛋白质相互作用分析
对蛋白质-蛋白质相互作用的分析表明，不同的自身抗原候选物主要通过两个Hub相互作用。一个Hub的候选自身抗原主要存在于线粒体中，而另一个Hub的候选自身抗原则存在于胞浆中。
3.聚类热图分析
应用聚类分析来检验所选重要蛋白质的合理性和准确性。簇1在阴性PBC患者中表达显著上调的蛋白。它们主要参与B细胞活化的阳性调节、吞噬功能的识别和补体活化。
簇2代表AMA阴性PBC患者中显著下调的蛋白。这些下调蛋白主要参与电子传递和细胞代谢过程，这些过程主要局限于线粒体。
讨论
在AMA阳性的PBC患者中，与线粒体相关的生物学过程被显著富集，与预期相符。但是在AMA阴性的PBC患者中也检测到了低水平的AMA抗原，似乎看来AMA阴性实际是不存在的，而其他研究也证实AMA阴性和AMA阳性之间确实存在一定的差异。作者推测自身抗原引起的免疫反应可能导致相关通路（吞噬识别、B细胞活化的阳性调节、补体活化）的功能障碍，从而导致独特的临床亚型AMA阴性的形成。
AMA作为PBC的特异性诊断标记物，在AMA阴性的中一直存在争议。约有10%的PBC患者不能检测到AMA。一些研究表明，因为临床检测的灵敏度低的原因，在血液中AMA存在测不到的情况，通过这次研究证实存在这种情况，相比较传统的AMA检测技术（间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验），质谱技术具有更高的灵敏度去检测AMA阴性PBC患者血液中的抗原。
后续实验建议：更大的样本量，包含健康和胆汁淤积的队列，酶联免疫吸附实验或者Western blot对候选的抗原进行验证。
总结
提升建议：
1.扩大样本数量
2.设置合理的空白对照
3.蛋白表达量验证
4.Biomarker特异性验证/蛋白功能验证
王健 撰文
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