褪黑素抑制种子油和花青素的积累

Melatonin represses oil and anthocyanin accumulation in seeds

合作单位：西北农林科技大学农学院

期刊：Plant Physiology（IF=6.305）

• 本研究发现基因SNAT1（5-羟色氨酸乙酰转移酶）和COMT（咖啡酸O -甲基转移酶）在拟南芥的种子中普遍存在且高表达，并且其对褪黑素的合成是必要的。

  
  

• 敲除SNAT1和COMT来封闭褪黑素的合成，显著增加成熟种子中油和花青素的浓度，反之，通过外源添加褪黑素增加褪黑素信号导致种子油和花青素的显著降低。

  
  

• 通过转录组学和RT-PCR技术分析基因表达水平，脂肪酸和花青素积累的重要基因在snat1-1 comt-1种子的成熟过程中是显著变化的。

  
  

• SNAT1 和 COMT显著调节成熟种子中粘液和原花青素的积累；

实验设计

研究结果

1、 SNAT1和 COMT在发育种子中丰富表达

1）利用GFP融合结构，35S:SNAT1-GFP 和 35S:COMT-GFP分析本氏烟的SNAT1和COMT的亚细胞定位，发现SNAT1-GFP和COMT-GFP分别定位于叶绿体(Figure 1A)和细胞质中(Figure 1B)，COMT-GFP和细胞核标志物DAPI是共定位的，表明COMT也存在于细胞核内

2）分析褪黑素合成所必须的SNAT1 和COMT在时间和空间的mRNA 分布，RT-qPCR用于观察野生型不同植物组织的表达，SNAT1除了茎外，在不同的组织中均高度表达(Figures 2A, B)，COMT广泛存在于不同的组织中，在根，花蕾，开花和发育种子的表达是高于茎，莲座叶和茎叶 (Figures 2D, E)

3）表达水平：种子发育时期，SNAT1和COMT表现出相似的模式，在授粉后第8天开始增加，第10天达到最大值，然后慢慢降低(Figures 2B, E)

4) 进一步观察SNAT1和 COMT的表达模式，15个独立的转基因pSNAT1:GUS 和pCOMT:GUS，结果表明SNAT1在不同的组织中是高度表达的，包括根(Figure 2C1)，子叶，莲座叶和茎叶(Figures 2C1-3)，花蕾和开放的花朵(Figures 2C1-3)，发育中的种子，包括胚胎和在种子成熟过程中的种皮(Figures 2C5-8)。COMT的转录水平在根组织中最高(Figure 2F1)，子叶和刚长出的真叶(Figure 2F1)，花蕾和开放的花朵(Figures 2F3, 4), 发育种子，包括胚和种皮(Figures 2F5-8). 在种皮中，SNAT1表达明显高于COMT(Figures 2C5-8 and 2F5-8)。同时，pSNAT1:GUS line的茎没有观察到GUS染色，pCOMT:GUS line的莲座叶(Figure 2F2)，茎叶(Figure 2F3)和茎也没有观察到GUS染色。

总而言之，GUS 染色和 RT-qPCR基因表达的结果是高度一致的，SNAT1 和 COMT在种子成熟中是高度表达的，两个基因的动态调节和褪黑素相关的种子代谢物的积累主要发生在种子成熟阶段；

Figure 1 本氏烟叶子中SNAT1(A)和COMT (B)蛋白的亚细胞定位

Figure 2  SNAT1和COMT的组织特异性表达模式

2、褪黑素抑制种子油和花青素的积累

1）在纯合子snat1-1和 comt-1 植物中没有检测到sni1和COMT转录本(Figures 3C and S1),确认都是功能缺失的突变体；在comt-2中T-DNA被插入到COMT基因的第二个内含子中，PCR的结果表明纯合子comt-2突变体是完全缺乏COMT转录物的

2）发育的长角果的野生型和SNAT1 和COMT的但突变体和双突变在授粉12天后的褪黑素水平进行分析（Figure 3D），三个单突变体snat1-1,comt-1和 comt-2与野生型植株相比，有更少的褪黑素产生，双突变体较相应的单突变体产生的褪黑素更少，双突变体snat1-1 comt-1仍然能够产生褪黑素，这与拟南芥中存在另一个SNAT的等基因（SNAT2）是一致的。表明SNAT1和COMT对于褪黑素的合成具有累加效果。

3）分析野生型和突变植株中主要的脂肪酸组成和脂肪酸含量（每微克成熟种子所包含的总脂肪酸，Figure 4A），三个单突变体植株的种子脂肪酸含量比野生型高6%，并且是所有类型的脂肪酸均有增加，双突变植株snat1-1 comt-1种子中脂肪酸含量是明显高于相应的单突变体，并且相较于野生型高17%，这表明SNAT1和COMT对拟南芥种子中脂肪酸的积累具有累加效应。

4）分析花青素在野生型和突变型植株种子中的含量 (Figure 4C)，SNAT1或COMT的缺失导致种子中花青素显著积累，相较于snat1-1突变植株，comt突变植株累积了更多的花青素，然而在单突变型comt和双突变型snat1-1 comt-1种子中花青素的积累没有明显的差异，这些结果表明SNAT1和COMT对于花青素积累无累加效应，且在种子的花青素合成中COMT比SNAT1更加重要。

5）进一步证实SNAT1和COMT对脂肪酸和花青素合成的影响，使用gSNAT1 and gCOMT导入 snat1-1 和 comt-1突变体，单突变体snat1-1 和 comt-1的低褪黑素浓度在SNAT1 和 COMT基因表达之后得以恢复到野生型水平(Figure 3D)，snat1-1和comt-1突变植株种子中脂肪酸和花青素的高浓度在引入gSNAT1 和 gCOMT后恢复到野生型水平(Figures 4A,C)，表明SNAT1和COMT对拟南芥种子中油和花青素的积累具有抑制效应；

6）分析野生型和突变型植株中外源添加褪黑素对脂肪酸积累的影响，外源添加褪黑素显著降低了野生型植株种子中油和花青素和合成(Figure 4B，4D)，单突变和双突变植株在外源添加褪黑素后，种子中油的浓度和野生型几乎是一样的，但单突变体是略低于双突变体，并稍微高于野生型。拟南芥种子中， SNAT1 和 COMT分别以独立的和累加的方式，主要是通过影响褪黑素的合成来抑制脂肪酸的积累。

7）分析野生型和突变型植株中外源添加褪黑素对花青素积累的影响，comt1-1和 snat1-1 comt-1突变体植株种子中花青素的含量是相同的，并且高于野生型植株(Figure 4D)，这些结果表明SNAT1抑制种子花青素的合成只能通过影响褪黑素的生物合成来实现，然而COMT抑制种子花青素的积累可以通过褪黑素的浓度和褪黑素的生物合成来实现。

总之，通过敲除SNAT1 或 COMT来关闭内源褪黑素的生物合成，并且通过外源添加褪黑素的实验，表明了褪黑素抑制了油和花青素的积累。除此之外，SNAT1和COMT，不依赖于褪黑素，在拟南芥种子中直接抑制油和花青素的生物合成。

Figure 3 来自不同类型的SNAT1和COMT的发育长角果中褪黑素的定量分析

Figure 4 内源缺失和外源添加褪黑素对种子中油和花青素积累的影响

3、野生型和双突变型植株在授粉12天后的转录组分析

在拟南芥发育种子中，脂肪酸在第六天开始积累，从第8天开始线性增加直到第18天，双突变植株snat1-1 comt-1相较野生型和单突变植株SNAT1 和 COMT积累更多的脂肪酸(Figure 4A)，除此之外，第12天是种子黄酮类，包括花青素生物合成的关键时期。因而分析授粉后第12天野生型和突变型植株的转录组分析，转录组测序分析确定了243个显著差异基因，其中119个基因是上调的，124基因是下调的。功能分析表明与油和花青素代谢相关的基因分别有12个(4.9%)和6个 (2.5%)。然而，与野生型相比，在双突变植株中油和花青素积累的其他关键基因的表达没有改变。9个上调基因(7.6%)与碳水化合物代谢相关，16个上调基因(13.4%)和30个下调基因(24.2%)的代谢是与蛋白质代谢相关的。野生型和双突变植株的种子存储蛋白的浓度没有实质性差异。与压力/防御反应和其他生物学过程相关的差异基因的数目占的比例较大。

因而，褪黑素合成的必须基因SNAT1和COMT的敲除，调控了油和花青素积累的一类列重要基因的表达，并且许多基因与种子成熟的生物学过程相关。

4、双突变植株种子不同发育阶段油和花青素相关的差异基因的证实

使用RT-qPCR比较野生型和双突变植株在种子成熟阶段（授粉12-16天）与油和花青素合成相关的基因的表达。

1）油积累相关的上调基因：选择一个调控基因WRINKLED1 (WRI1)和5个结构基因生物素羧基载体蛋白1 (BCCP1), 乙酰辅酶A羧化酶羧化转移酶α亚基 (CAC3), 丙二酰辅酶A-ACP 丙二酰转移酶 (MCAMT), 质体脂肪酶1 (PLIP1), 和 脂质转移蛋白3 (LTP3)，12-16天双突变植株所有的6个基因的表达均高于野生型植株(Figure 5)，WRI1的相对表达逐渐增加，与野生型相比，双突变植株的LTP3的相对表达在12-16天显著减少。因此，BCCP1 和 CAC3的表达模式类似于WRI1。MCAMT和 PLIP1的相对表达水平从12天开始增长，到14天到达峰值，然后又慢慢降低。

2）对于花青素合成高表达的基因，挑选了两个调控基因，KELCH-DOMAIN-CONTAINING F-BOX PROTEIN39 (KFB39) and KANADI4 (KAN4),和四个结构基因, 4-香豆酸辅酶A连接酶1 (4CL1), 查耳酮异构酶 (CHI), UDP-葡糖基转移酶 73B2 (UGT73B2),和葡萄糖-6-磷酸/磷酸转移蛋白2 (GPT2), 除了第16天GPT2的表达，所有6个基因在12天到16天的表达水平在双突变植株与野生型植株相比均发生了变化(Figure 6)。与野生型相比，KFB39的相对表达水平总是显著更低的，在双突变植株中UGT73B2, KAN4和GPT2的表达水平从12天到16天一直降低。4CL1和 CHI的相对表达水平从12天开始增加，到14天到达峰值，然后又减少。

总之，同时敲除褪黑素合成的必需基因SNAT1 和COMT，通过调控种子成熟过程中油和花青素合成的一系基因来抑制种子中油和花青素的积累，

Figure 5野生型(Col-0)和snat1-1 comt-1植株种子发育过程中油积累相关基因的动态表达分析

Figure 6野生型(Col-0)和snat1-1 comt-1植株种子发育过程中花青素积累相关基因的动态表达分析

5、SNAT1和 COMT种皮黏液的生产有相反的作用

先前研究表明，拟南芥种子的种皮黏液和脂肪酸竞争光合作用产物，因而分析是否褪黑素影响种皮粘液的产生，

1）snat1-1突变植株产生更少的粘液，然而comt突变植株的种皮相较于野生型积累更多的粘液(Figure 7A)。而且，双突变型植株与对应的单突变型植株相比粘液较少，和野生型产生的粘液差不多，这与转录组学的结果一致。

2）外源添加褪黑素到野生型植株后，种皮中粘液的积累未发生改变，表明褪黑素对于种皮粘液生物合成没有效果，尽管SNAT1和COMT对种皮粘液产生具有相反作用。

3）观察SNAT1和COMT单独对于种皮粘液生产影响，使用RT-qPCR比较授粉8到12天（种皮粘液沉积的重要阶段）DF1和 MUM4的表达，在snat1-1 DF1和 MUM4的表达是显著下调的(Figure 7B)，而在comt-1 发育种子中两者的表达是显著上调的(Figure 7C)，在snat1-1和 comt-1 发育种子中引入gSNAT1 和gCOMT后，变化的DF1 和MUM4能够完全恢复到野生型水平。

这些结果表明SNAT1 和 COMT对种皮粘液的生产具有相反的效果，在拟南芥发育的种子中不是通过影响褪黑素合成对其作用，而是调节DF1 和 MUM4的表达

Figure 7  SNAT1和COMT对种皮黏液沉积的影响

6、SNAT1 和 COMT抑制种皮原花青素的积累

由于黄酮类转化为花青素和原花青素，因而花青素和原花青素可能竞争黄酮类物质，为了去检测这一假说，观察SNAT1 和 COMT对原花青素积累的影响，其主要沉积于种皮。

1）二甲基氨基肉桂醛染色分析表明，与野生型相比，在单突变型和双突变型植株中种皮中原花青素的水平是显著增加的 (Figure 8A)，

2）花青素的酸性水解实验表明，与野生型相比，在单突变型和双突变型植株中种皮中可溶性原花青素的水平是显著增加的(Figures 8B, C)

3）单突变体植株中高水平的原花青素在引入gSNAT1和 gCOMT又恢复到野生型水平(Figures 8B, C)

4）值得注意的是，comt植株种子中总原花青素和可溶性原花青素的含量均高于snat1-1种子，且与sn61-1 comt-1种子相当(Figures 8B, C)。

这些结果表明，SNAT1和COMT以非累加的方式影响原花青素的合成，抑制拟南芥种皮原花青素的沉积，COMT比SNAT1发挥更大的作用。

Figure 8  SNAT1和COMT对种皮原花青素积累的影响

研究总结

总的说来，本研究发现种子成熟过程中褪黑素通过抑制油和花青素合成中重要基因的表达抑制其积累；拟南芥种子中，褪黑素合成的必须基因SNAT1 和COMT可以直接对油，花青素，原花青素和粘液的合成其作用；种子代谢产物的积累不仅需要代谢路径的关键步骤，也需要光合作用的产物。这些研究帮助了解褪黑素的功能，为种子中油和花青素积累的调控网络提供深入的见解，同时为产油作物和植物的种子中油和黄酮类物质的提高提供可能的基因靶点。