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重磅!靶向蛋白质组PRM助力新冠病毒检测


靶向蛋白质组PRM助力新冠病毒检测

Development of a parallel reaction monitoring (PRM) mass spec-trometry-assay for the detection of SARS-CoV-2 spike glycoprotein and nucleoprotei

研究对象:新冠病毒刺突蛋白(S)和核蛋白(NP)

研究方法:平行反应监测(PRM)

期刊:Analytical Chemistry

影响因子:6.8



2020年9月,阿斯利康研发中心的Sonja Hess团队在Analytical Chemistry杂志(IF=6.8)发表了基于质谱的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(S)和核蛋白(NP)的PRM检测方法,使得在生物体液中对新冠病毒进行灵敏,准确的检测成为可能。


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研究背景



目前,新冠疫情仍在世界范围内蔓延,对于新冠病毒灵敏,精准和快速的检测需求与日俱增。作为目前新冠病毒检测的主要方法,核酸检测(RT-PCR)所需的PCR引物和RNA抽提试剂不能满足在短时间内对上亿人群进行广泛检测。而由于感染SARS-CoV-2的人体内产生抗体的时间延迟,另外的基于宿主血清中SARS CoV-2抗体的检测,对于预防疾病传播的作用不大。除此之外,基于抗原检测的方法之前已经被应用到呼吸道病毒,如流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测中。虽然最近也有基于抗原的新冠病毒的检测方法的提出,但仍受到低灵敏度和准确度的困扰。


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图1. SARS-CoV-2病毒检测方法概览





研究步骤



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研究思路


1
PRM候选监测肽段的筛选


首先,研究者体外表达纯化了SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(S),并且重组了SARS-CoV-2病毒核蛋白(NP)。为了模拟体液样本的复杂体系,将S与NP蛋白参入肺上皮细胞分泌粘液中。样本先进行Lys-C/trypsin酶解,使用DDA模式进行质谱数据采集。


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图2. SARS-CoV-2病毒S与NP蛋白PRM鉴定及定量方法流程图


对于S蛋白,质谱鉴定的肽段覆盖率达到84%,并且鉴定到17个糖基化位点。为了提高肽段覆盖率,研究人员又使用trypsin和chymotrypsin进行酶解,肽段覆盖率达到97.1%,并且鉴定到额外5个糖基化位点。糖基化位点的鉴定结果与之前报道的S蛋白的22个糖基化位点一致。对于NP蛋白,Lys-C/trypsin酶解之后肽段覆盖率为77.2%,并且鉴定到一个与之前报道的一致的S176位的磷酸化位点。


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图3. S与NP蛋白序列覆盖率及用于PRM监测的肽段筛选


基于蛋白高覆盖率的鉴定结果,结合肽段的信号响应,研究人员建立了最初用于PRM监测的S与NP蛋白的肽段列表,共包含了7条肽段(S蛋白4条,NP蛋白3条)。研究人员合成这7条肽段的重标肽段,与相应轻标肽段一起放入inclusion list进行PRM监测。此外,inclusion list还包括了iRT肽段对保留时间进行校准,分泌粘液的5AC和5B肽段作为酶解质控。



2
PRM检测方法的建立


为了确定PRM检测方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ),研究人员设置了一系列S与NP蛋白在分泌粘液体系中的酶解产物稀释浓度点,每个浓度点均参入等量的重标肽段,建立了从3 amol到12.5 fmol跨度4个数量级的L/H校正曲线。同时,研究人员也设置了重标肽段横跨3 amol到12.5 fmol的稀释浓度点,每个浓度点参入等量的轻标肽段,建立相反的H/L校正曲线。每个浓度点以每天3次技术重复,两天重复检测的方式进行质谱检测(质谱洗脱梯度为7分钟),每条肽段使用4个表现最好的离子对的峰面积加和进行定量。S和NP蛋白的肽段根据三个因素(肽段信号响应,两天重复建立的校正曲线的精确度,L/H和H/L校正曲线的吻合情况)进行排序,从而在7个候选肽中进一步挑选出4个。NP蛋白表现最好的肽段为(DQVILLNK: aa 348-355)和(ADETQALPQR: 376-385),S蛋白表现最好的肽段为(NIDGYFK: 196-202)和(FQTLLALHR: aa 238-246)。该4条肽段的LOD,LOQ及校正曲线的r2值见表1。


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表1. S与NP蛋白用于PRM检测的肽段评估结果


为了进一步对候选肽进行评估,研究人员检查了这4条肽段的漏切位点。使用校正曲线的定量结果,研究人员计算了目标肽段不同漏切形式所占的总体峰面积比值(表1)。ADETQALPQR肽段的漏切形式KADETQALPQR占总共峰面积的近30%,NIDGYGFK漏切形式占总体峰面积的18.9%,导致这两条肽段不能作为完美的S或NP蛋白靶标肽段。因此,研究人员最后确定的S蛋白的靶标肽段为DQVILLNK,NP蛋白的靶标肽段为FQTLLALHR。二者的校正曲线均有极高的r2值,并且LOD和LOQ分别为195和390 amol(图4)。


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图4. S与NP蛋白代表性肽段的色谱图及校正曲线



3
PRM检测方法的验证


在使用体外表达纯化的S蛋白和重组NP蛋白进行了PRM方法建立之后,研究人员将感染SARS-CoV-2病毒的肾上皮细胞上清液进行病毒灭活,将12.5μL和3.125μL分别参入分泌粘液复杂体系中,构建高低两个浓度的病毒样本,同时设置空白的分泌粘液样本,对前期建立的PRM检测方法进行验证。样本酶解物同样以三次技术重复,三天重复检测的方式进行PRM检测。


如图5A所示,使用NP蛋白靶标肽段的校正曲线定量到的高低两个病毒浓度的NP蛋白量分别为227和422 amol。低浓度样本浓度仅仅略高于PRM检测的LOD(195 amole),高浓度样本浓度高于检测的LOQ(390 amole)。空白的粘液样本显示体系的干扰较弱,在定量限之下。低浓度样本在三天之间的定量变异系数(CV)为8.1%,而高浓度样本CV值较高,为24%。低浓度和高浓度样本在日内三次技术重复的CV值均低于日间,分别为2.1%和11.7%。


如图5B所示,使用S蛋白靶标肽段的校正曲线定量到的高浓度样本S蛋白量为553 amole,低浓度样本的S蛋白在LOD之下。高浓度样本的日内变异系数为7.9%,日间变异系数较高,为28.7%。不论是NP蛋白,还是S蛋白,高浓度样本的日间变异系数都较高,其原因可能是高浓度样本的酶解效率更易受到复杂体系或者病毒灭活过程的影响。


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图5. PRM检测方法验证结果





总结



目前,获取RNA提取试剂和PCR引物的困难阻碍了RT-PCR对新冠病毒检测的快速广泛应用。而基于抗原的检测方法,不需要特殊的提取试剂,且病毒可以完全灭活之后再进行检测。因此,本文建立的基于PRM的抗原检测方法可以提供更高的安全性及检测通量,有潜力在临床上作为RT-PCR检测之外的SARS-CoV-2检测工具进行广泛应用。





拜谱生物研发人员是中国国内最早从事PRM技术服务的人员具备10年以上蛋白组学、修饰蛋白质组学、代谢组学、转录组学、基因组学等科研服务经验,提供各类样本分析方案与实验设计方案。已合作发表多篇高水平项目文章,欢迎来电咨询。



                                                                                                 

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