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Nature microbiology | 腺病毒介导的泛素化改变了蛋白质-RNA的结合和艾滋病毒RNA的加工


腺病毒介导的泛素化改变了蛋白质-RNA的结合和艾滋病毒RNA的加工

Adenovirus-mediated ubiquitination alters protein–RNA binding and aids viral RNA processing

研究对象: Mock和E1B55K-E4orf病毒感染的Hela细胞

样本类型:Hela细胞

组别设置:3例Mock的Hela细胞,3例E1B55K缺失的病毒感染的Hela细胞

研究方法:泛素化蛋白组学和蛋白质组学

期刊:Nature microbiology

影响因子:15.54



Nature microbiology | 腺病毒介导的泛素化改变了蛋白质-RNA的结合和艾滋病毒RNA的加工




研究背景
Nature microbiology | 腺病毒介导的泛素化改变了蛋白质-RNA的结合和艾滋病毒RNA的加工



病毒通过攻击宿主的泛素化来对抗或者重新定向细胞过程,从而来促进感染。腺病毒编码两个早期蛋白,E1B55K E4orf6共同利用细胞泛素化连接酶复合物来克服宿主的防御从而促进病毒的生产。缺少E1B55K  E4orf6的腺病毒突变体导致病毒RNA加工和病毒生产的缺陷,但先前确定的连接酶的底物不能解释这一表型。来自费城儿童医院和宾夕法尼亚大学的研究人员,使用泛素化蛋白质组学蛋白质组学分析MockE1B55K-E4orf的病毒感染细胞发现两个RNA结合蛋白,RALY hnRNP-C被泛素化且没有降解。E1B55K-删除的病毒感染中,RALYhnRNP-C的敲除增加了病毒RNA的剪接,蛋白丰度和后代产生。E1B55K-删除的病毒感染导致hnRNP-C 和病毒 RNA之间相互作用的增强,从而导致病毒RNA加工的衰减。其研究成果发表在2020713日的Nature microbiology杂志上(IF=15.54)。

 





研究思路
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研究结果
Nature microbiology | 腺病毒介导的泛素化改变了蛋白质-RNA的结合和艾滋病毒RNA的加工
1
E1B55K-E4orf6对病毒后期RNA剪接是必须的



E1B55K-E4orf6复合体引起的泛素化可用于蛋白酶体降解,或者在不影响蛋白丰度的情况下会影响蛋白功能。本研究通过E1B55K 删除或者cullin-5抑制,来评估E1B55K/E4orf6-介导的泛素化对病毒RNA加工和蛋白表达的影响。


  • 与野生型(WT) Ad5比较,感染具有E1B55K突变的病毒,明显减少了病毒晚期蛋白的生产(比如六邻体蛋白,五邻体蛋白,纤维蛋白和蛋白质VII),但对早期蛋白的生产基本无影响(Fig. 1b);


  • 假设cullin-5抑制可以模拟ΔE1B的感染,NEDD8的修饰可以激活cullin连接酶,这一过程可以被小分子MLN4924抑制, NEDDi抑制作用通过免疫印迹进行确认,结果表明是cullin-5发生了修饰,同时降低了MRE11和BLM的降解(Fig. 1b);


  • 野生型WT Ad5感染中NEDDi可以大幅度地降低病毒晚期蛋白,但对于早期蛋白DBP的表达仅有轻微的减少,在ΔE1B中对晚期蛋白的表达基本无影响,然而WT Ad5中E1B55K的水平在NEDDi作用后增加,可能是自身泛素化的抑制作用,这在泛素化连接酶的底物识别成分中是普遍存在的(Fig. 1b);


  •  NEDDi 或E1B55K 缺失对病毒RNA处理的影响,主要是晚期启动子(MLP)和纤维区域的晚期转录水平在WT Ad5感染后在NEDDi是降低的,类似于ΔE1B的感染;


  • NEDDi和E1B55K缺失均降低了病毒晚期转录本(MLP和fiber)的剪接效率,但对早期E1A的效率没有负面影响,由于不正确的剪接会引起核的保留和未剪接RNA的降解,假设剪接失败可以解释病毒晚期RNA的出口缺陷或者减少,通过原位荧光杂交检测fiber的转录水平,表明在NEDDi 和E1B55K 缺失后细胞质中存在比较少的fiber RNA。E1B55K/E4orf6导向的泛素化对于Ad晚期RNA剪接,输出和蛋白生产是重要的。


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1  E1B55K的缺失或cullin介导的泛素化抑制可降低晚期RNA剪接和整体RNA加工




2
蛋白质组学揭示E1B55K–E4orf6复合体存在时,RNA结合蛋白RBPs发生泛素化



为了确定E1B55K–E4orf6 复合体的泛素化底物,本研究使用蛋白质组学和泛素化蛋白质组学进行分析,从非复制的病毒载体中表达了E1B55KE4orf6,检测已知的底物的降解动力学来确定最优条件。


  •  E1B55K 和 E4orf6引起38个肽段泛素化水平的显著增加(Fig. 2b),除此之外,51个肽段仅在E1B55K 和E4orf6表达后发生了泛素化,而在对照组是没有的,在E1B55K和E4orf6表达后泛素化增加或唯一泛素化的底物包括已知的靶点MRE11和RAD50,46个蛋白在E1B55K和E4orf6表达后总蛋白丰度显著降低,其中包括已知的E1B55K- E4orf6复合物底物;


  • 肽段水平的泛素化分析转换成蛋白水平,确定了120个宿主蛋白质作为病毒复合物引起泛素化的假定底物,其中,25个泛素化蛋白质的丰度减少,包括已知的靶点MRE11 和RAD50,91蛋白质的泛素化水平增加,但是整体蛋白质丰度没有变化,这些蛋白质被预测作为非降解的底物(Figure 2c,d);


  • 预测E1B55K和E4orf6底物的GO分析表明主要是“poly(A)RNA结合”和“RNA-结合”(Figure 2e),由于E1B55K的删除可以引起RNA处理的缺陷,因而重点关注包含在RNA相关类别功能中的26个蛋白质,7个RNA结合蛋白仅在E1B55K 和E4orf6处理后有泛素化修饰(Figure2f),其中,RALY有最高的泛素化水平,其他的RNA结合蛋白中,hnRNP-C是一个RALY互作蛋白质,它的很多泛素化位点是增加的,蛋白和蛋白相互作用数据库Reactome表明hnRNP-C和RALY处于同一个互作网络模块,并且其中包含很多已经报道与病毒相关的蛋白质,RALY和hnRNP-C在所有的组织中均是高表达的,并且它们参与RNA加工的多个过程,包括剪接和运输,并且,hnRNP-C可结合Ad晚期转录本,因而后期选择RALY和hnRNP-C作为E1B55K/E4orf6导向的泛素化底物进行验证。同时,本研究也发现了其他细胞过程中潜在的泛素化底物,包括脱泛素化(USP5, USP16 和USP25),折叠伴侣蛋白(多为热休克蛋白),胞内运输(RAB家族成员),代谢(柠檬酸合成)和抗原呈递(TAP1和TAP2)。


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2  蛋白质组学显示了腺病毒的E1B55K-E4orf6复合物中假定的未降解底物中的RNA结合蛋白




3
RALYhnRNP-CE1B55KE4orf6表达后发生泛素化但没有降解



RALYhnRNP-C享有43%的同源性,并且在卷曲螺旋域中享有63%的同源性,卷曲螺旋域包含所有的确定的泛素化增加相关的赖氨酸残基,RALY中检测到的单泛素化位点和hnRNP-C具有高度的保守性,由于E1B55K能够招募底物进行泛素化,因而研究了E1B55K和宿主RBP之间的相互作用。


  •  WT中E1B55K的IP实验可以分离出RALY和hnRNP-C,但ΔE1B感染中是没有的(Fig. 3b),在WT感染后的RALY和hnRNP-C的IP实验中均可以检测到E1B55K,因而证实了E1B55K–E4orf6复合体和这些蛋白之间的相互作用,同时也证实了RALY和hnRNP-C之间的相互作用;


  • 为了证实E1B55K/E4orf6引起的泛素化作用, RALY–Flag或者hnRNP-C–Flag,和血凝素(HA)泛素化以及E4orf6一起转染到HEK293细胞(这个细胞系称其为E1B55K),HA的IP实验表明E4orf6表达后产生了RALY和hnRNP-C的高分子量泛素复合物(Fig. 3c),同时NEDDi降低了E4orf6引起的RALY 和 hnRNP-C的泛素化,证实了hnRNP-C在WT中是泛素化的但在ΔE1B 感染中是没有的


  • 全细胞蛋白组学分析表明RALP和hnRNP-C丰度在E1B55K 和E4orf6表达后是恒定的(Fig. 3f),RALP和hnRNP-C的表达水平在环乙酰亚胺处理后也是恒定的(Fig. 3g),因而可以假设——E1B55K 和E4orf6可以促进不同底物比如降解底物和非降解底物的泛素化,因而分析了不同底物的泛素化差异,包括MRE11, AD50, RALY和 hnRNP-C。使用有无蛋白酶抑制剂MG132的HEK293进行转染病毒的泛素化分析(Fig. 3h),E4orf6表达增加了MRE11的泛素化,并且在蛋白酶抑制剂加入后进一步增加,这与E1B55/E4orf6介导的泛素化引起MRE11的降解一致,相反,E4orf6表达增加了RALY 和hnRNP-C的泛素化,在MG132处理后进一步增加,这表明RALY 和hnRNP-C的泛素化很可能不会导致蛋白的降解;


  • 最常与蛋白酶体降解相关的泛素连接是K48,为了探索K48的连接,进行本地HA-泛素化IP分析,比较使用脱泛素化酶(DUBs)处理后泛素化水平的变化,这个酶可以是任意链接的(DUBPan)或K48特定链接的(DUBK48),MRE11和RAD50在两种DUB处理后泛素化明显减少,然而,RALY 和 hnRNP-C在DUBPan处理后降低,而DUBK48处理后没有变化,这表明了RALY和 hnRNP-C是non-K48泛素化的底物,这与降解底物MRE11和RAD50是不一样的,RALY and hnRNP-C是通过E1B55K–E4orf6进行泛素化的,并且没有随后的蛋白酶体的降解。


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3  RALYhnRNP-C是腺病毒E1B55K/E4orf6介导的泛素化的非降解底物




4
 RALY  hnRNP-C不利于病毒晚期RNA的加工过程



为了确定RALY hnRNP-C是否影响腺病毒的感染,使用短干扰RNA(siRNA)敲除分析HeLaHBEC3-KT细胞感染WT 或者 ΔE1B病毒情况。


  • RALY和hnRNP-C敲除在野生型中不影响病毒蛋白质水平,表明完整的病毒感染时,这两个蛋白的存在对于病毒蛋白质水平没有显著的影响,而在ΔE1B病毒感染中,RALY和hnRNP-C蛋白质缺失可以挽救病毒晚期蛋白的缺陷(Fig. 4a),


  • 分析敲除是否影响后续ΔE1B病毒的后代生产,ΔE1B病毒相较于野生型感染产生的病毒颗粒减少了100倍,在删除RALY和hnRNP-C蛋白后病毒的生产能力明显得到改善,这些都表明RALY 和hnRNP-C对腺病毒的感染是有害的,E1B55K/E4orf6介导的泛素化解除了这一限制(Fig. 4a);


  • 由于RALY和 hnRNP-C均参与RNA剪接和运输,假设其删除在不影响早期感染阶段的前提下,可以选择性增加晚期RNA加工,因而使用qPCR通过定量基因组积累来检测病毒DNA复制(Fig. 4c);ΔE1B病毒DNA复制相较于WT,减少了2倍,在RALY和 hnRNP-C删除后,病毒DNA的积累没有发生显著的变化,这确定了RALY和 hnRNP-C的作用效果是发生在病毒基因组复制之后,因而分析了病毒早期(E1A)和晚期(MLP and fiber)转录物的RNA水平(Fig. 4d),RALY和 hnRNP-C的删除挽救了MLP 和 fiber的转录水平与WT相当,但对E1A转录物水平没有影响,ΔE1B病毒中MLP和 fiber的剪接效率降低,敲除RALY和 hnRNP-C后,其剪接效率得以恢复到WT水平(Fig. 4e),siRNA处理也增加了ΔE1B感染中细胞质RNA染色纤维,虽然不影响WT(Fig. 4f);


  • RALY和hnRNP-C敲低完全挽救了NEDDi缺陷,而不影响病毒早期蛋白或RNA水平(Fig. 4g–i),RALY和hnRNP-C对Ad感染的晚期阶段是有害的,泛素化或缺失可以克服这些缺陷。


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4  RALYhnRNP-C敲除挽救了由缺少E1B55K E4orf6复合物导致的RNA加工缺陷




5
感染引起hnRNP-C RNA结合的全局性变化



病毒介导的RALYhnRNP-C的非降解性泛素化可以解除对病毒晚期RNA加工的限制,例如,非降解性泛素化可以通过模糊核定位序列来改变蛋白质的定位,因而通过免疫荧光来定位RALYhnRNP-C,先前的研究表明,RALY hnRNP-C在非感染细胞中位于核质中而不是核仁中。


  • 在感染后,这两个蛋白质被排除在DBP 或 USP7标记的复制中心之外,这与病毒RNA和其他RBP的模式相匹配,然而,在WT和ΔE1B的感染中,没有明显的定位差异,这表明病毒引起的泛素化不改变定位。RALY和hnRNP-C的泛素化是位于卷曲螺旋结构域(Fig. 3a),这一区域是参与多聚化和蛋白-RNA相互作用,因而在感染期间通过交联剂双琥珀酰亚胺辛二酸酯DSS处理细胞来观察蛋白复合物的形成是否受到影响,交联引起RALY和hnRNP-C的泳动变化,这与多聚化一致,这一模式在WT和ΔE1B感染中是类似的,表明病毒引起的泛素化不能显著影响蛋白复合物的形成;


  • 使用靶向蛋白组学分析确定hnRNP-C的 RNA结合区域(RBP-ID),使用SILAC蛋白组学分析WT(light)和ΔE1B(heavy)感染的细胞,在感染24h后进行蛋白质-RNA之间的光交联, hnRNP-C的IP实验,核酸酶处理,蛋白酶解,质谱分析。发生RNA交联和肽段会保留RNA加合物,与对照相比较,这会引起质量偏移和未修饰信号的缺失,因而heavy/light的降低可以确定蛋白质的RNA结合区域(Fig. 5a),未感染的细胞中,hnRNP-C最强的结合区域是RNA识别基序(RRM),为ploy-U基序提供特异性,研究表明,WT和ΔE1B感染,RRM的RNA结合显著降低,然而卷曲螺旋结构域中RNA结合显著增加,hnRNP-C泛素化位点下游大约20个氨基酸区域的RNA结合峰在mock可以检测到,在WT感染后降低,ΔE1B感染后升高,因而表明这个区域是被Ad介导的泛素化影响的一个潜在区域;


  • RALY的CO-IP实验中,检测了感染介导的RRM相互作用的变化,WT和ΔE1B近泛素化位点泛素化介导的潜在差异,结果表明感染期间的hnRNP-C相互作用仅有很小的差异,总之,RBR-ID揭示了hnRNP-C的RNA结合在感染时期的变化,Ad5 WT和ΔE1B之间潜在的泛素化介导的差异。




6
在无泛素化的情况下,病毒晚期RNAhnRNP-C  RALY之间的相互作用增强



确定Ad介导的泛素化对hnRNP-C和病毒RNA相互作用的影响,进行交联免疫共沉淀CLIPRT–qPCR,使用hnRNP-C转录产物作用阳性对照,GAPDH作为阴性对照。


  • 与WT相比,ΔE1B感染的晚期蛋白有2-4倍特异性的增加,但早期蛋白基本没有差异,表明病毒引起的hnRNP-C的泛素化特异性降低其与晚期转录物之间的相互作用,由于整体上泛素化水平相较于蛋白丰度是很低的,因而这些变化表明局部效应或者是主要负面影响,这些结果在10%的输入物质上线性缩放,相比之下,hnRNP-CLIP- qPCR在没有紫外交联或免疫球蛋白(IgG)对照实验中,只沉淀了极少的RNA;


  • 由于能得到的RALP抗体是不够的,因而使用诱导RALY-Flag细胞系进行Flag CLIP–qPCR实验,ΔE1B感染后,RALY和晚期病毒RNA的相互作用也是增加的,然而早期RNA结合是没有变化或者减少的;


  • 在WT感染时,使用NEDDi进行hnRNP-C CLIP–qPCR实验,类似于ΔE1B感染结果,hnRNP-C和晚期蛋白之间的相互作用增加了2倍多,这一结果进一步支持了在没有E1B55K-E4orf6复合物的情况下,hnRNP-C与病毒晚期RNA的相互作用增加(Fig. 5c);


  • 为进一步确定感染期间的泛素化是否会改变hnRNP-C的RNA结合,使用eCLIP-seq进行全局性结合位点的分析(Fig. 5d)。在感染之后,与宿主RNA结合的hnRNP-C发生大幅度的减少,在未感染情况下,检测到>24,000的峰,仅有3000个是在3个处理条件下均存在的(Fig. 5e),结合motif分析,揭示共有的和特有的结合基序(Fig. 5f),宿主的转录物种hnRNP-C是感染特有的,表明泛素化在hnRNP-C RNA结合中发挥着一定的作用,在宿主转录物种病毒特异性的hnRNP-C poly-U motif是减少的,这与hnRNP-C RRM实验中RNA结合减少相吻合(Fig. 5a);


  • WT和ΔE1B感染中病毒转录物中hnRNP-C峰的位置和数目是不一样的(Fig. 5g,h),WT和ΔE1B病毒的特异性峰表明E1B55K删除增加了hnRNP-C与晚期转录物的相互作用(Fig. 5i),在主要晚期转录单元的L3-L5区域差异尤为明显(Fig. 5g),这些与CLIP–qPCR 结果吻合(Fig. 5b),几个病毒晚期RNA的hnRNP-C结合位点对ΔE1B感染时特有的,比如MLP和fiber(Fig. 5g)。在病毒转录物分析中没有看到hnRNP-C的poly-U的偏好性(Fig. 5j)。然而,宿主和病毒转录本中感染特异性hnRNP-C结合位点最显著的基序是相似的。虽然该基序在模拟感染条件下存在,但它不在已鉴定的RNA结合基序前列(Fig. 5f)。这表明感染改变了hnRNP-C主要和次要RNA结合位点之间的平衡。


    RBR-ID和eCLIP-seq数据阐述了感染时hnRNP-C 结合的RNA变化,E1B55K/E4orf6引起的泛素化能够克服对RNA加工的不利影响,通过减少 hnRNP-C 和 RALY与病毒晚期RNA结合来发挥作用。


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5在缺少E1B55K E4orf6复合物时,hnRNP-C与病毒晚期RNA的相互作用增加

 




本研究的亮点
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因而,本研究使用定量蛋白质组学泛素化蛋白组学来确定E1B55K/E4orf6-介导的泛素化底物,通过IP实验证实泛素化酶和底物之间的相互作用,并通过表型验证了泛素化底物的重要作用,然后通过蛋白质组学和CLIP分别分析蛋白质和RNA的结合部位,阐述E1B55K/E4orf6的完整作用机制——病毒介导的RALY hnRNP-C的泛素化解除了对病毒RNA加工的限制,从而表明非降解性泛素化底物在病毒感染后的细胞过程中发挥着重要的作用。


原文链接:

https://www.nature.com/articles/s41564-020-0750-9




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