The plant cell(IF=12)|山大丁兆军团队揭示生长素促进侧根发生的新机制

侧根的形成受到植物激素生长素的严格调控,但关于生长素调控侧根形成的分子机制研究很少。2024年2月,山东大学丁兆军教授团队The plant cell (IF=12)上发表了题为“MAC3A and MAC3B mediate degradation of the transcription factor ERF13 and thus promote lateral root emergence”的研究论文。本研究采用LC-MS/MS蛋白质谱分析对转基因拟南芥幼苗进行了研究,揭示了生长素通过MPK14-MAC3A和MAC3B信号模块消除抑制因子ERF13,从而促进拟南芥侧根出现的分子机制。拜谱生物为该研究成果提供了LC-MS/MS蛋白质谱分析,这项研究的结果将加深我们对MAC3A和MAC3B在侧根发育和植物生长中对环境条件响应中作用的理解。


The plant cell(IF=12)|山大丁兆军团队揭示生长素促进侧根发生的新机制

文章名称:MAC3A and MAC3B mediate degradation of the transcription factor ERF13 and thus promote lateral root emergence(The plant cell,IF=11.6,2024.2)

客户单位:山东大学

研究材料:拟南芥幼苗

拜谱提供技术:LC-MS/MS蛋白质谱分析



/ 研究结果 /




1

ERF13与泛素连接酶MAC3A和MAC3B相互作用

为了研究生长素触发ERF13降解的机制,对转基因Pro35S:ERF13-MYC拟南芥幼苗进行了质谱分析,旨在鉴定ERF13相互作用蛋白,特别强调寻找泛素连接酶。在84个候选的ERF13-相互作用蛋白基因中,重点研究了泛素连接酶MAC3B及其同源蛋白MAC3A,它们具有82%的蛋白质序列相似性。通过拟南芥原生质体的共免疫沉淀(Co-IP)实验和烟叶的荧光素酶互补成像(LCI)实验证实了ERF13与MAC3A和MAC3B的相互作用(图1A和1B)。

MAC3A和MAC3B是U-box型E3连接酶家族的成员,U-box结构域促进E2泛素偶联酶的募集以降解靶蛋白。值得注意的是,LCI分析显示,与全长MAC3A和MAC3B相比,ERF13与MAC3AΔU-box和MAC3BΔU-box(缺乏U-box结构域)的相互作用更强(图1C),这表明全长MAC3A和MAC3B可能参与ERF13的降解。正如预期的那样,在LCI检测中,26S蛋白酶体抑制剂MG132显著增强了ERF13与全长MAC3A和MAC3B之间的相互作用。此外,叶片的双分子荧光互补(BiFC)实验显示,ERF13与细胞核中的MAC3AΔU-box和MAC3BΔU-box相互作用(图1D),这与最近关于ERF13核定位的发现一致。

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图1| ERF13与MAC3A和MAC3B相互作用

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)



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MAC3A和MAC3B在LR的发生中起重要作用

对拟南芥幼苗的组织化学β葡萄糖醛酸酶(GUS)染色结果显示:MAC3A和MAC3B在发育的各个阶段普遍表达于各种植物组织中,包括嫩叶、初生根尖、柱状茎和LRP(图2A)。此外,MAC3A在植物中的表达检测表明,MAC3AGFP在LRP发育的各个阶段均有表达,并在侧根和初代根细胞中定位于细胞核(图2B),这与保护细胞中MAC3A的核定位一致。

对MAC3A和MAC3B单双突变体的LRs表型研究表明:单突变体的LR密度与野生型(WT)相当,而MAC3A和MAC3B双突变体的LR总密度和侧根(LRE)密度与野生型相比显著降低(图2C和2D)。这些结果表明,MAC3A和MAC3B冗余并积极调节LR的出现。此外,将ProMAC3A: MAC3A-GFP导入MAC3A MAC3B中,恢复了突变体的根系发育表型,包括LR密度降低和主根变短(图2C和2D)。这些结果表明,MAC3A和MAC3B除了在LR发育中发挥作用外,也是主根发育的重要调节因子。

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图2| MAC3A和MAC3B调节LR发育。

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)



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MAC3A和MAC3B抵消了ERF13对LR发育的抑制作用

单体发展受阻的四期MAC3A MAC3B突变,导致IV期LRP的频率增加,而V至VIII期LRP的频率降低(图3A和3B)。经过重力刺激后,MAC3A和MAC3B幼苗70%以上的LRP仍处于IV期,这与Pro35S:ERF13-MYC转基因植株的观察结果相似(图3C)。与ERF13和E3连接酶MAC3A和MAC3B在LR出现中的拮抗作用一致,在MAC3A MAC3B突变体中,观察到KCS8、KCS16和KCS18的表达水平显著降低(图3D)。虽然在WT幼苗中过表达MAC3A和MAC3B并没有促进LR的出现,但它恢复了Pro35S:GFP-ERF13幼苗中LREs的密度和KCSs的表达水平(图3E和3F)。此外,在MAC3A MAC3B突变背景下,ERF13的突变使LRE和总LR密度恢复到WT水平(图3G和3H),表明ERF13在LR紧急情况中作用于MAC3A和MAC3B的下游。

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图3| ERF13和E3连接酶MAC3A和MAC3B拮抗调节LRP的发育

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)



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MAC3A和MAC3B泛素化并降解ERF13

通过在原生质体中表达ERF13- flag、泛素- myc和MAC3A-GFP、MAC3B-GFP或GFP的各种组合,用MG132处理原生质体以抑制ERF13的降解,并与抗flag抗体进行共IP。结果MAC3A和MAC3B都表现出使ERF13泛素化的能力(图4A)。将ERF13-FLAG(含或不含泛素- myc)引入WT和MAC3A MAC3B中,结果与WT相比,MAC3A和MAC3B中ERF13- flag的泛素化程度降低(图4B),表明内源性MAC3A和MAC3B可以泛素化植物中的ERF13。将Pro35S:MAC3B- myc引入到转基因Pro35S:GFP-ERF13植株中,检测了MAC3B过表达对ERF13蛋白水平的影响。结果观察到MAC3B过表达后ERF13的丰度显著降低(图4C)。此外,MAC3B水平升高显著缩短GST-ERF13的半衰期至41.0分钟(图4D和4E)。这些结果有力地支持了MAC3A和MAC3B促进ERF13泛素化和降解的观点。

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图4| MAC3A和MAC3B泛素化并降解ERF13

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)


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MAC3A和MAC3B调节生长素诱导的ERF13降解

用环己亚胺(CHX)处理Pro35S:GFP-ERF13和Pro35S:GFPERF13/Pro35S:MAC3B-MYC幼苗,然后用或不加NAA处理它们,阻断它们的蛋白质生物合成。NAA处理增加了WT中ERF13的降解率,并且通过过表达MAC3B进一步提高了降解率(图5A和5B)。此外,NAA介导的ERF13降解在MAC3A和MAC3B中明显受损(图5A和5B)。通过在拟南芥原生质体中进行Co-IP实验,研究了生长素处理是否会增强ERF13与这些E3连接酶之间的相互作用。结果显示NAA处理显著增加了ERF13与这些E3连接酶之间的相互作用(图5C和5D)。总的来说,这些发现证实生长素通过增强这些E3连接酶与ERF13之间的相互作用,促进了MAC3A-和MAC3B介导的ERF13降解。

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图5| MAC3A和MAC3B调节生长素诱导的ERF13降解

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)


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MAC3A和MAC3B优先与MPK1- 磷酸化的ERF13相互作用并降解

为了验证生长素诱导的ERF13磷酸化增强了其与MAC3A和MAC3B的结合,通过Co-IP实验验证了两个ERF13的变体(ERF13DDD和ERF13AAA)与MAC3A和MAC3B的相互作用。MAC3A-GFP和MAC3B-GFP与ERF13AAA-MYC的相互作用略弱,而与ERF13DDD-GFP的相互作用要强得多(图6A和6B)。BiFC (rBiFC)和LCI分析进一步证实了这一点(图6C和6D)。此外,尽管ERF13DDD和ERF13AAA的降解对NAA处理都不敏感,但无论NAA处理如何,这两个版本的ERF13蛋白在MAC3A和MAC3B中都变得特别稳定(图6E)。

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图6| MAC3A和MAC3B优先与mpk14磷酸化的ERF13相互作用并降解

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)


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生长素诱导LRP中MAC3A和MAC3B的积累

NAA处理导致ProMAC3A: MAC3A-GFP /MAC3A MAC3B幼苗中MAC3A-GFP水平升高(图7A和7B),表明生长素对这些E3连接酶具有积极作用。此外,NAA处理后,ProMAC3A:GUS和ProMAC3B:GUS幼苗的MAC3A和MAC3B转录本水平升高(图7C), ProMAC3A:GUS和ProMAC3B:GUS的组化GUS染色增加(图7D),表明生长素正调控MAC3A和MAC3B启动子活性。NAA治疗后arf7-1和arf19-1中MAC3A和MAC3B的转录检测显示,NAA诱导的MAC3A和MAC3B转录在ARF7 -1和ARF19 -1单突变体中减弱,在ARF7 -1和ARF19 -1双突变体中完全消失(图7E),这表明生长素诱导的MAC3A和MAC3B转录依赖于ARF7和ARF19。综上所述,生长素通过协同调节MAC3A和MAC3B的转录和蛋白质稳定性,诱导了它们在LRP中的积累。

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图7| 生长素诱导MAC3A和MAC3B转录

(图源:Yu Z., et al., The plant cell., 2024)




/ 拜谱小结 /




综上所述,研究揭示了生长素诱导的ERF13降解调控LR发生的分子机制。强调了ERF13和E3连接酶MAC3A和MAC3B在控制LR发展中的拮抗作用,并为生长素介导的LR发展背后的复杂调控网络提供了有价值的见解。对MAC3A和MAC3B的靶点和功能的进一步研究加深了对它们在LR发育和植物生长中对环境条件的响应中的作用的理解。这一过程中拜谱生物提供了LC-MS/MS蛋白质谱分析技术,拜谱生物已建立了完善成熟的转录组学、蛋白组学、代谢组学以及多组学联合产品技术服务体系,欢迎咨询!

参考文献:Yu Z, Qu X, Lv B, Li X, et al. MAC3A and MAC3B mediate degradation of the transcription factor ERF13 and thus promote lateral root emergence. The plant cell. 2024 Mar 13; koae047. doi: 10.1093/plcell/koae047.

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