J Agric Food Chem | S-亚硝基化对猪肉品质的影响

屠宰前应激会引起猪肉的颜色、质地和持水性的改变,限制猪肉行业的发展,造成巨大的经济损失。屠宰前应激源主要包括驱赶、装载、运输等。其中,屠宰前运输在畜牧业中较常见且不可避免,被认为是影响肉制品质量的关键因素。屠宰前运输引起的急性应激可能通过介导肌肉的能量代谢、离子平衡、蛋白水解、蛋白质氧化和细胞凋亡过程来损害肉质,目前对于屠宰前运输压力导致的肉质变化的分子机制仍未确定。

2023年12月10日,国家肉品质量安全控制工程技术研究中心张万刚团队在Journal of Agricultural and Food Chemistry(IF=6.1)上发表题为“Modification-Specific Proteomic Analysis Reveals Cysteine S‑Nitrosylation Mediated the Effect of Preslaughter Transport Stress on Pork Quality Development”的研究文章。研究人员探讨屠宰前转运胁迫对宰后猪胸长肌(LT)蛋白S-亚硝基化水平和S-亚硝基化蛋白质组的影响,结果表明高转运应激通过促进NO合成酶(NOS)活性和神经元NOS(nNOS)表达诱导一氧化氮(NO)过量产生,从而显著增加死后肌肉中蛋白质S-亚硝基化水平。该成果中拜谱生物提供了S-亚硝基化修饰蛋白质组学技术服务,为遭受屠宰前运输压力的猪的宰后肉质变化提供新的见解。


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文章名称:Modification-Specific Proteomic Analysis Reveals Cysteine S‑Nitrosylation Mediated the Effect of Preslaughter Transport Stress on Pork Quality Development(J Agric Food Chem.,IF=6.1,2023.12)

客户单位:国家肉品质量安全控制工程技术研究中心

研究材料:猪胸长肌

分组信息:

低应激组(LS)1、12和24小时猪胸长肌(L1、L2、L3)

高应激组(HS)1、12和24小时猪胸长肌(H1、H2、H3)

拜谱提供技术:亚硝基化修饰蛋白质组学





摘要图

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研究内容

研究人员首先通过检测血浆应激指标和肉质发现HS组的血浆肌酸激酶(CK)活性显著高于LS组(p < 0.05),表明HS组猪的屠宰前应激水平较高;HS组的肌肉样本相对于LS组来说肉的颜色和持水能力的代谢率发生了明显的变化。此外,HS组中与NOS活性和nNOS含量变化相对应的NO含量高于LS组,这表明宰后肌肉中存在不同的蛋白质S-亚硝基化水平。为证实这一猜测,研究人员进行总蛋白S-亚硝基化水平检测,发现不同屠宰前转运应激水平的猪宰后肌肉中蛋白质S-亚硝基化水平显著不同,表明NO及其诱导的蛋白S-亚硝基化可能是屠宰前转运应激诱导的肉品质变化的介质。

为了探索宰后1小时猪肌肉中S-亚硝基化蛋白质组的改变,研究人员采用生物素富集与TMT定量蛋白质组学方法相结合来测定蛋白质谱(图2A)。样本中总共检测到来自439种蛋白质的1100个S-亚硝基化半胱氨酸位点(图2B)。其中63.6%的S-亚硝基化蛋白有一个S-亚硝基化位点,约17%蛋白有两个S-亚硝基化位点,还有约8%蛋白被检测到具有3个S-亚硝基化位点(图2C)。此外,85%的S-亚硝基化蛋白分子量低于105 kDa,其中50%低于40 kDa(图2D)。这一结果Western blot分析一致,大多数S-亚硝基化蛋白在100 kDa以下,主要集中在25-55 kDa范围内,表明小分子量的蛋白质可能更容易被S-亚硝基化修饰。

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图2| S-亚硝基化修饰蛋白组学

(图源:Chao Ma, et al., J Agric Food Chem., 2023)


为了可视化两组之间的差异S-亚硝基化半胱氨酸位点研究人员进行了聚类层析。如图3A所示,S-亚硝基化半胱氨酸位点丰度在组内的相似性较高,而组间的相似性极差,表明不同屠宰前转运应激水平的猪LT肌肉中宰后生化反应机制存在差异。与LS组相比,HS组鉴定到属于63个蛋白质的101个显著上调的S-亚硝基化半胱氨酸位点,以及属于22个蛋白质的32个显著下调的位点(图2B和图3B,p < 0.05)。随后研究人员分析了差异S-亚硝基化蛋白的亚细胞定位,进一步探索屠宰前运输胁迫诱导的S-亚硝基化如何影响猪肉品质。如图3C所示,差异S-亚硝基化蛋白主要定位于细胞质、膜、线粒体和细胞外区域,其中细胞质比例最高(46.2%),表明S-亚硝基化可能与细胞结构有关,并在细胞质中参与各种生化调节途径(例如糖酵解、Ca2+释放和细胞凋亡),这些途径可能介导宰后猪肉品质的改变。以半胱氨酸位点为中心点分析21个氨基酸残基的一级序列基序结果如图3D所示,在差异S-亚硝基化半胱氨酸位点中仅鉴定出一个潜在基序(xxxxxxxxxxCxxxxxxGxxx),表明甘氨酸(G)通常位于S-亚硝基化半胱氨酸位点的+7位置。此外,该研究还通过绘制S-亚硝基化半胱氨酸位点两侧氨基酸的频率热图(±10位置)显示了20种常见氨基酸在S-亚硝基化半胱氨酸位点两侧的分布模式(图3E)。综合上述研究结果,证实S-亚硝基化半胱氨酸侧翼氨基酸的典型和主要分布模式是被疏水结构域包围的带电氨基酸,这可能进一步有利于NO适应周围的生物环境,并通过S-亚硝基化途径发挥其信号转导作用。

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图3| S-亚硝基化蛋白和位点

(图源:Chao Ma, et al., J Agric Food Chem., 2023)


随后对差异蛋白进行生信分析,亚硝基化蛋白按生物过程、分子功能和细胞成分分类(图4A)。在生物过程中,差异蛋白主要参与肌肉系统过程(肌肉收缩、肌肉细胞发育和肌肉细胞分化)和代谢过程(嘌呤核糖核苷一磷酸、嘌呤核苷一磷酸和核苷一磷酸)。在分子功能中,差异蛋白具有结合功能,包括肌动蛋白丝结合、离子结合、钙离子结合和细胞骨架蛋白结合。差异蛋白质的主要细胞成分与细胞质、细胞外区域和肌原纤维(如收缩纤维、肌节和超分子纤维)有关。此外,通过KEGG通路分析筛选了与差异蛋白相关的多种代谢通路。如图4所示,Ca2+和 HIF-1信号通路是环境信息处理的重要途径。差异亚硝基化富集在糖酵解/糖异生、碳代谢、氧化磷酸化(OXPHOS)和氨基酸的生物合成等途径。此外,还构建了PPI网络来研究差异蛋白之间的相互作用(图4C)。其中,第一个也是最大的集群与Ca2+体内平衡密切相关(基因名称:ATP2C2和RYR1)和肌肉萎缩(基因名称:TNNC1、MYH2、MYL3、FBN1、FLNC、MYOM2、TPM3、PDLIM和ACTN2),而第二和第三簇是糖酵解酶(基因名称:PGAM2、ALDOA、PGK2、TPI1和LDHAL6A)和氧化还原酶(基因名称:SDHC、NDUFA8、NDUFA6和PRDX5),主要与宰后肌肉的能量代谢有关(图5)。总而言之,差异蛋白的生物信息学分析表明细胞骨架和Ca2+主要参与肌肉萎缩的相关蛋白以及参与能量代谢的糖酵解酶和氧化还原酶相互作用,它们可能共同在肉质变化中起关键作用。

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图4| 差异S-亚硝基化的生物信息学分析

(图源:Chao Ma, et al., J Agric Food Chem., 2023)

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图5| 蛋白相互作用网络

(图源:Chao Ma, et al., J Agric Food Chem., 2023)


该研究为猪LT肌肉中S-亚硝基化水平和S-亚硝基化蛋白质组差异对屠宰前转运应激的响应提供了直接证据。结果表明,HS组表现出高于LS组的S-亚硝基化修饰水平。此外,差异蛋白主要参与Ca2+处理、肌肉系统过程(肌纤维收缩和肌细胞发育等)和宰后肌肉能量代谢(OXPHOS、磷酸肌酸转化和糖酵解),这展现了它们在介导宰后肌肉收缩、pH值下降和由此产生的肉质改变中的作用(图6)。HS组中许多差异蛋白表现出较高的丰度,其中一些(如PGK、L-LDH、TPI、CK、RyR1、FHL1和SDHC)可以作为预测新鲜猪肉品质和肉类分级的潜在生物标志物。

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图6| 蛋白质半胱氨酸S-亚硝基化介导的屠宰前运输胁迫对猪肉品质发育的影响示意图

(图源:Chao Ma, et al., J Agric Food Chem., 2023)






拜谱小结

作者测定猪胸长肌的S-亚硝基化蛋白质并分析其蛋白变化,筛选的差异蛋白主要参与肌肉收缩和能量代谢的调节,它们可能共同介导肉质的改变。该研究从NO诱导蛋白S-亚硝基化修饰的角度出发,有助于更深入地了解屠宰前转运胁迫导致肉品质劣化的生化机制。这一过程中拜谱生物提供了亚硝基化修饰蛋白质组学技术服务。拜谱生物作为一家国内领先的多组学公司,在半胱氨酸氧化还原修饰领域组积累了丰富的项目经验,成功助力Nature文章发表,可提供棕榈酰化、亚硝基化、谷胱甘肽化、次磺酸化、硫巯基化、Total氧化还原、游离巯基蛋白质组学检测服务,欢迎致电咨询!




参考文献:Ma C, Zhang W, Zhang J, Du T. Modification-Specific Proteomic Analysis Reveals Cysteine S-Nitrosylation Mediated the Effect of Preslaughter Transport Stress on Pork Quality Development. J Agric Food Chem. 2023 Dec 20. doi: 10.1021/acs.jafc.3c05254.







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