Free Radic Biol Med |中山大学吴忠道/沈佳团队揭示亚硝基化诱导日本血吸虫内质网应激并抑制虫体发育

宿主特异性作为疾病生态学中一个异常重要的领域长期被广泛研究,但许多机理至今仍扑朔迷离。由血吸虫感染引起的血吸虫病表现出典型的宿主特异性,大鼠对血吸虫具有天然抗体,血吸虫在其体内不能完全发育。目前已有大量研究证明一氧化氮(NO)的抑制作用与抑制日本血吸虫线粒体氧化呼吸有关,然而,并没有研究表明NO是否可以诱导血吸虫中的内质网应激,此外,尚不清楚大鼠血吸虫发育的抑制是否与血吸虫内质网功能受损有关。

2024年2月,中山大学中山医学院吴忠道/沈佳团队Free Radical Biology and Medicine(IF=7.4)上发表了题为“Nitric oxide-induced endoplasmic reticulum stress of Schistosoma japonicum inhibits the worm development in rats”的文章。该研究通过体外培养实验和体内日本血吸虫感染大鼠模型,研究了NO对大鼠日本血吸虫发育的抑制是否与内质网胁迫有关,以及日本血吸虫的内质网应激是否影响其线粒体功能。阐明这些问题将有助于深入了解大鼠抗血吸虫的机制,并可能为针对血吸虫病和其他寄生虫病的药物开发提供潜在的策略。拜谱生物为该研究成果提供了S-亚硝基化修饰组学技术,结果证明大鼠体内高水平的一氧化氮可以诱导日本血吸虫发生内质网应激,从而抑制其在大鼠体内发育。


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文章名称:Nitric oxide-induced endoplasmic reticulum stress of Schistosoma japonicum inhibits the worm development in rats(Free Radical Biology and Medicine,IF=7.4,2024.2)

客户单位:中山大学中山医学院

研究材料:血吸虫虫体

拜谱提供技术:S-亚硝基化修饰组学






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研究内容




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1.S-亚硝基化修饰组学为NO对大鼠蠕虫发育的抑制作用提供了机制上的见解

为了进一步探究NO抑制大鼠日本血吸虫发育的机制,作者对从感染大鼠和小鼠中采集的日本血吸虫进行了S-亚硝基化修饰组学研究。在日本血吸虫中共鉴定出2719个半胱氨酸位点,对应1299个蛋白质。与小鼠相比,大鼠有2346个可靠的S-亚硝基化位点上调,只有1个下调(图1A)。通路富集分析结果表明,差异S-亚硝基化蛋白主要与重要的代谢过程相关,包括碳代谢、糖酵解、丙酮酸代谢、柠檬酸循环等(图1B)。以上结果表明,NO可能通过S-亚硝基化扰乱日本血吸虫的代谢过程,从而抑制大鼠蠕虫的发育。此外,通过GO分析结果显示13个S-亚硝基化蛋白位于线粒体中,9个S-亚硝基化蛋白位于内质网中(图1C)。图1D所示,从大鼠中采集的日本血吸虫中一些上调的S-亚硝基化蛋白参与了蛋白质转运、蛋白质折叠、蛋白质结合、未折叠蛋白质结合和蛋白质折叠伴侣,其中从感染大鼠中采集的日本血吸虫蛋白质折叠伴侣的S-亚硝基化修饰显著高于感染小鼠。综上表明,NO可能在大鼠中诱导日本血吸虫的未折叠蛋白反应(UPR)。

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图1|S-亚硝基修饰组学为NO对大鼠蠕虫发育的抑制作用提供了机制上的见解

(图源:Peng M., et al., Free Radical Biology and Medicine., 2023)


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2.NO诱导感染大鼠日本血吸虫内质网应激

为了研究UPR(ER应激)是否参与NO对大鼠日本血吸虫发育的抑制作用,作者首先利用电镜分析了小鼠、WT大鼠和iNOS大鼠收集的日本血吸虫ER形态学。结果表明,发育良好的小鼠和iNOS大鼠的内质网紧密地包裹在这些多层结构中,内质网形态正常,结构清晰,排列有序(图2A)。而WT大鼠发育不良的日本血吸虫内质网扩张、肿胀,形成大量环状内质网螺旋,并被空泡膜吞没(图2B)。统计分析结果显示,与小鼠和iNOS大鼠的日本血吸虫内质网相比,WT大鼠的内质网长度明显减少,内质网环状螺旋(异常内质网)数量明显增加(图2C-D)。WT大鼠的内质网形态异常与二硫硫苏糖醇所致内质网应激的内质网形态特征一致。此外,通过Q-PCR进一步检测分析发现,与小鼠日本血吸虫相比,WT大鼠日本血吸虫中GRP78和GRP94的表达水平显著升高(图2E和F),表明大鼠日本血吸虫发生了内质网应激反应。然而,当iNOS大鼠体内缺乏NO时,与WT大鼠体内发育不良的日本血吸虫相比,日本血吸虫中GRP78和GRP94的表达明显降低(图2E和F),这表明iNOS大鼠体内发育良好的线虫的内质网应激受到了显著抑制。

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图2|ER应激发生在受感染的WT大鼠的日本血吸虫中。在感染后6周从感染动物身上采集日本血吸虫.

(图源:Peng M., et al., Free Radical Biology and Medicine., 2024)


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3. 抑制大鼠内质网应激促进血吸虫的发育和存活

为了检验日本血吸虫的内质网应激是否与大鼠蠕虫的发育停滞直接相关,该研究将内质网应激抑制剂4-PBA注射到WT大鼠体内。如图3A所示,用4-PBA处理后,日本血吸虫中ER的损伤显着降低,与对照组(PBS)中发现的液泡内的ER螺旋相比,ER呈现出连续的网膜结构(图3A-C)。此外,大鼠内质网应激抑制剂4-PBA显著抑制了日本血吸虫GRP78和GRP94的表达,抑制了细胞凋亡的发生(图3D–I)。结果表明,4-PBA可有效抑制大鼠内质网应激。值得注意的是,与对照组相比,日本血吸虫对大鼠内质网应激的抑制促进了较大尺寸蠕虫的发育(图3J-K),并显著增加了蠕虫负荷(图3L)。此外,与对照组相比,4-PBA处理组沉积在大鼠肝脏中的蠕虫对产下的卵显着增加(图3M)。总的来说,这些数据强烈表明,抑制大鼠日本血吸虫的内质网应激可以促进寄生虫的发育,增加肝脏中的卵沉积并加重大鼠的病理损伤。

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图3|抑制大鼠日本链球菌的内质网应激可促进寄生虫的发育和存活

(图源:Peng M., et al., Free Radical Biology and Medicine., 2024)


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4.日本血吸虫NO诱导的内质网应激与Ca2+的外流有关

作者进一步探讨了NO诱导日本血吸虫内质网应激的机制。从感染大鼠和小鼠身上采集的日本血吸虫进行的S-亚硝基化修饰结果显示,不同的硝基化蛋白参与钙离子转运、钙离子跨膜转运活性、钙离子结合和钙离子稳态(图1D)。众所周知,内质网是Ca2+储存的重要细胞器。因此,推测NO诱导的内质网应激可能导致内质网损伤,从而导致内质网释放Ca2+。为了验证这一观点,作者在体外检测了NO诱导内质网应激后日本血吸虫体内Ca2+的水平。结果表明,与对照组相比,SNP处理6和24h后,Ca2+水平显著升高(图4A)。然而,当NO诱导的ER应激被ER应激抑制剂4-PBA抑制后,NO诱导的高水平Ca2+水平显著降低,特别是在共培养后6h(图4A)。这些结果表明NO诱导的内质网应激可能与钙离子稳态失衡有关。此外,Ca2+通道阻滞剂2-氨基乙氧基二苯硼酸盐(2-APB,肌醇1,4,5-三磷酸受体(IP3R)抑制剂)被用于抑制Ca2+从内质网外排,维持内质网内Ca2+浓度。结果表明,NO诱导的高水平Ca2+被2-APB显著抑制(图4B)。因此,接下来通过2-APB抑制内质网Ca2+外排后,进一步检测NO诱导的日本血吸虫内质网应激。结果表明,与SNP组相比,Ca2+通道的抑制显著降低了GRP78和GRP94的表达,抑制NO诱导的Ca2+释放可以缓解日本血吸虫内质网应激,恢复内质网稳态(图4C-D)。因此,这些结果表明,NO诱导的内质网应激与钙离子从内质网外排有关,钙离子外排导致内质网Ca2+浓度降低,引发内质网应激。

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图4|NO诱导内质网应激与内质网Ca2+外排有关。

(图源:Peng M., et al., Free Radical Biology and Medicine., 2024)


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5.NO诱导的日本血吸虫内质网应激与线粒体氧化呼吸功能受损直接相关

之前的一项研究已经证实大鼠体内高水平NO通过影响血吸虫的线粒体呼吸来阻断血吸虫的发育。在这里,作者还发现从感染大鼠和小鼠收集的日本血吸虫S-亚硝基化修饰组学结果中,差异S-亚硝基化蛋白参与线粒体呼吸链复合物组装和线粒体电子传递,细胞色素c到氧(图1D)。与小鼠相比,大鼠体内日本血吸虫线粒体电子传递链末端酶细胞色素c氧化酶亚基IV(CcO)的S-亚硝基化修饰增加(图5A)。这些结果与之前的研究结果一致。在本研究中,作者进一步研究了NO诱导的内质网应激是否会导致大鼠日本血吸虫线粒体功能受损。为了验证这一假设,作者检测了SNP诱导的内质网应激和4-PBA抑制内质网应激后日本血吸虫的线粒体功能和线粒体形态。用日本血吸虫CcO活性评价线粒体呼吸功能。与对照组相比,用4-PBA抑制NO诱导的内质网应激后,SNP处理的日本血吸虫的CcO活性显著降低,部分恢复(图5B)。此外,比较了SNP组和SNP + 4-PBA组日本血吸虫线粒体形态。结果表明,SNP组蠕虫线粒体肿胀,嵴断裂,嵴结构消失。然而,当NO诱导的内质网应激被4-PBA抑制时,日本血吸虫线粒体表现出相对清晰的细胞膜外壁和清晰的嵴结构(图5C-D),在体内也发现了类似的结果(图5E-F)。这表明抑制内质网应激可以减轻日本血吸虫线粒体损伤。

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图5|NO诱导的内质网应激与日本血吸虫线粒体氧化呼吸损伤和线粒体损伤有关。

(图源:Peng M., et al., Free Radical Biology and Medicine., 2024)






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拜谱小结




综上所述,该研究结果表明,高水平的NO可以诱导日本血吸虫的内质网应激,从而参与阻断大鼠日本血吸虫的发育。此外,该研究还证明了日本血吸虫的NO诱导内质网应激与Ca2+的外流有关。众所周知,内质网、线粒体和Ca2+的功能与体内平衡密切相关,但它们的因果关系在不同条件和不同细胞中存在很大争议。因此,这项研究显著增强了对NO、ER应激、线粒体功能障碍和Ca2+之间关系的理解,进一步阐明了大鼠抗血吸虫的机制,揭示了日本血吸虫在宿主中的寄生特征。这些结果可能为针对血吸虫病或其他寄生虫病的药物开发提供潜在的策略。这一过程中拜谱生物提供了S-亚硝基化修饰组学技术,拜谱生物作为一家国内领先的多组学公司,在棕榈酰化修饰积累了丰富的项目经验,助力Nature文章发表;并已完成半胱氨酸修饰蛋白质组学产品的全面升级,现可提供棕榈酰化、亚硝基化、谷胱甘肽化、次磺酸化、硫巯基化、Total 氧化还原、游离巯基蛋白质组学检测服务,助力发表高分文献,欢迎致电咨询!




参考文献:Peng M, Zhao S, Hu Y, Zhang L, Zhou T, Wu M, Xu M, Jiang K, Huang Y, Li D, Lun ZR, Wu Z, Shen J. Nitric oxide-induced endoplasmic reticulum stress of Schistosoma japonicum inhibits the worm development in rats. Free Radic Biol Med. 2024 Feb 20;212:295-308. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2023.12.032.




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