Nat Commun(IF17.694)|临床微量FFPE样本的蛋白质组和磷酸化修饰组检测

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基于质谱的蛋白质组学分析方法被广泛应用于研究癌症中基因变化对蛋白质水平的影响,有助于监测癌症信号转导的变化。福尔马林固定石蜡包埋(Formalin Fixed Paraffin Embedded,FFPE)样本具有数量多、稳定性高和随访信息完整等特点,成为回顾性临床研究的宝贵资源。蛋白质组学研究的关键步骤就是蛋白质的提取和前处理过程,对于临床样本来说更是需要关注和解决的问题。

2021年,来自柏林Max Delbrück分子医学中心、柏林卫生研究所(BIH)的研究人员在国际权威期刊Nature Communications发表了题为“Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories”的文章。该研究比较和优化了FFPE样本蛋白质提取方案,对非小细胞肺癌(NSCLC)的FFPE样本进行了全面的蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱分析比较,凸显了使用FFPE样本进行无偏修饰组学分析的巨大前景,为深入了解肺癌和其他类型癌症的发病机制提供了帮助。


Nat Commun(IF17.694)|临床微量FFPE样本的蛋白质组和磷酸化修饰组检测
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英文标题:Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories

中文标题:回顾性临床癌症样本库的微量蛋白质组和磷酸化蛋白质组学特征

期刊:Nature Communications

影响因子:IF=17.694

发表时间:2021年

研究材料:临床肺癌FFPE切片

组学技术:蛋白质组、磷酸化蛋白质组

Nat Commun(IF17.694)|临床微量FFPE样本的蛋白质组和磷酸化修饰组检测



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1.FFPE蛋白质组学的蛋白质提取方案

研究人员比较了三种提取FFPE样本中蛋白质的方法,并对FFPE肺组织样本进行蛋白质组分析(图1 a),结果表明,SDS-SP3具有整体蛋白质组覆盖率高、肺癌相关蛋白质组覆盖率高以及四次重复的重复性高等优势(图1 b-d),在三种样品制备方案中表现最佳,因此被选中用于后续实验。

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图1 FFPE蛋白质组分析中三种样品制备方案的比较

(图源:Friedrich C, et al., Nat Commun, 2021)


2.FFPE样本蛋白质组/磷酸化蛋白质组定量策略

研究者比较了TMT和LFQ两种检测方法,结果显示与LFQ相比,TMT方案多鉴定出6000多种蛋白质,覆盖了近10000种蛋白质,跨越6个数量级;而LFQ仅覆盖约1800种蛋白质,并且许多与NSCLC相关的标志物如肿瘤蛋白p63仅在TMT方案中检测到(图2 b-c)。PI3K-AKT信号通路在NSCLC中起着重要作用,该通路的大多数蛋白在TMT方案中被量化(图2 d);对于磷酸化蛋白质组,在TMT标记方法中量化了超过14,000个磷酸化位点(图2 e)。通过比较蛋白质组和磷酸化蛋白质组的差异倍数,发现几种蛋白质在ADC和SCC之间被差异磷酸化,而蛋白质丰度保持不变。这表明,标准的TMT标记技术可以成功地应用于临床FFPE样本,同时提供蛋白质表达和磷酸化水平鉴定和定量的相关信息。

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图2 FFPE深度蛋白质组检测

(图片再编辑,源自:Friedrich C, et al., Nat Commun, 2021)


3.微量TMT分析方法


标准的TMT方法非常适用于样本库中FFPE组织的研究,但是这一方法并不适用于微量的样本。为了解决这一问题,研究团队开发了一个微量TMT定量方法(microscaled TMT)。结果显示每个TMT组定量了超过7000个蛋白质;活检等效物和微量TMT方法的相关性良好(图3 b),有近6000个磷酸化位点重叠(图3 c)。

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图3 微量TMT方法可实现微量样本蛋白质组深度覆盖

(图源:Friedrich C, et al., Nat Commun, 2021)



4.微量TMT方法在临床FFPE活检中的应用



为了测试微量TMT方法在临床FFPE活检中的效果,研究人员使用SDS-SP3处理了一组独立的FFPE针刺活检样本。结果表明,共定量近6800个蛋白质,涵盖了5个数量级的报告离子强度,磷酸化修饰组可定量5200种磷酸化肽段(图4 a-b)。使用微量TMT方法检测临床活检样本和活检等效物,结果发现,两组可以定量到相似数量的蛋白质,重叠率为78%(图4 c);临床活检样本定量的磷酸化位点少于活检等效物,这可能是由于活检和切除组织的细胞组成略有不同(图4 d)。

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图4 临床FFPE活检的深层蛋白质组和磷酸化蛋白质组

(图源:Friedrich C, et al., Nat Commun, 2021)




5.LFQ和TMT方法的FFPE蛋白质组/磷酸化蛋白质组比较


研究人员通过对常用的FFPE蛋白质提取方法、定量方法和样本量进行了系统的比较,并对FFPE蛋白质组分析制定一般指南:LFQ只需要少量的样本量和相对较短的样品制备时间,因此,LFQ特别适合于微量样本,以及大队列样本的高通量研究;TMT方法适合20~200例临床FFPE样本的高深度定量研究;而微量TMT方法,适用于微量(临床穿刺活检等)样本的高通量、高覆盖的蛋白质组学分析。

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图5 FFPE样本蛋白质组/磷酸化修饰组定量方法

(图源:Friedrich C, et al., Nat Commun, 2021)




Nat Commun(IF17.694)|临床微量FFPE样本的蛋白质组和磷酸化修饰组检测



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综上所述,该研究对常用的FFPE蛋白质提取方法、定量方法和样本量进行了系统的比较,并提供了FFPE蛋白质组的多种分析方法,为在功能蛋白质组水平上探索基因改变对癌症的影响提供了多种技术选择。



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蛋白质组学分析的关键步骤是蛋白质的提取和前处理过程,以保证下游检测的灵敏度。文中对于FFPE样本的处理使用了SDS-SP3技术,SP3是主流的样品处理技术之一,可对蛋白质实现无偏倚和几乎无损的处理。同时文中使用TMT方法,实现了临床FFPE样本的高深度检测。

拜谱生物微量蛋白质组学,是针对极微量、珍稀样本,以及一些特殊样本(比如FFPE样本、临床穿刺组织、脑脊液等)提出的全新解决方案。与文中使用TMT的检测方法不同,拜谱生物微量蛋白质组使用全新4D-DIA的技术,可实现近乎100%的离子利用率,同时灵敏度、扫描速度、分离能力全面提升,既能满足鉴定深度又能兼顾稳定性,尤适用于大队列样品的分析。

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参考文献:Friedrich C, Schallenberg S, Kirchner M, et al. Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories. Nat Commun. 2021;12(1):3576. Published 2021 Jun 11. doi:10.1038/s41467-021-23855-w.




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