超高深度DIA·磷酸化修饰组|多位国际大牛多个案例,与您共同赏析direct DIA的高水平应用


超高深度DIA·磷酸化修饰组|多位国际大牛多个案例,与您共同赏析direct DIA的高水平应用

蛋白质磷酸化是最重要的翻译后修饰(PTMs)之一,它可以通过改变蛋白质的活性、亚细胞定位、相互作用或稳定性来快速调节蛋白质的功能,基本上可以调节所有的信号网络。但这种修饰蛋白的丰度远低于未修饰蛋白,并且修饰状态多变,导致传统使用的数据依赖性采集(DDA)存在检测效率低及重复性较差的问题,尤其是在大队列样本分析中,问题更加显著。而DIA重复性高,定量准确,适合大队列样本的分析,但因其全扫描的性质,谱图解析较为困难,需要预先建立图谱库,增加了额外的建库成本。

随着技术的不断发展与革新,无需构建图谱库的DIA分析(direct DIA)策略逐渐崭露头角。direct DIA,作为一种新型的DIA定量技术,与常规的DIA分析方法相比,无需进行DDA分级建库,直接利用机器深度学习解析DIA质谱原始谱图,在留了DIA高通量、高重现、高准确的特点的同时提高了效率、降低了成本拜谱生物新推出的超高深度DIA·磷酸化修饰组便采用了这种快速高效、高通量、大规模的定量方法,可实现单针检测40000+磷酸化位点的鉴定深度,为深度挖掘数据潜在信息提供了可能性。接下来就来看看direct DIA在高分文献中的应用吧。


1、Nat Comm(IF17.694):肿瘤细胞的direct DIA磷酸化修饰组分析

文献名称:Rapid and site-specific deep phosphoproteome 

profiling by data-independent acquisition without the need 

for spectral libraries(2020)

作者信息:丹麦哥本哈根大学、诺和诺德基金会蛋白质研究中心副主任Jesper V. Olsen团队(Jesper V. Olsen教授博士阶段师从德国马普所Matthias Mann教授)

组学技术:direct DIA磷酸化蛋白质组学

样本类型:人类上皮宫颈癌HeLa细胞,人类视网膜色素上皮RPE1细胞,酵母细胞

研究内容:该研究对DIA磷酸化蛋白质组学数据分析流程进行了优化。作者使用direct DIA的方法,在15min的采集时间内鉴定超过20000个磷酸化肽段,显示了基于DIA特别是direct DIA的磷酸化蛋白质组的准确性、特异性和高深度。相较于DIA,direct DIA工作流程更简单,并且不会在建库过程中过滤掉稀少或者丰度较低的磷酸化位点,具有非常大的应用前景。最后作者通过系统分析30种激酶抑制剂在表皮生长因子(EGF)信号通路中的作用,证明了DIA方法的可扩展性,并提出该方法可能有助于肿瘤的精准医疗。

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激酶实验验证基于direct DIA的磷酸化蛋白质组工作流程

(图源:Bekker-Jensen DB, et al., Nat Commun, 2020)


2、Nat Comm(IF=17.694):空间蛋白质组学揭示亚细胞磷酸化水平的动态变化

文献名称:Spatial-proteomics reveals phospho-signaling 

dynamics at subcellular resolution(2021)

作者信息:丹麦哥本哈根大学、诺和诺德基金会蛋白质研究中心副主任Jesper V. Olsen团队

组学技术:direct DIA蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学

样本类型:Hela细胞,小鼠肝脏、肾脏组织

研究内容:该研究提出了一种连续提取并分离细胞内不同成分的工作流程,并将其与基于direct DIA的LC-MS/MS技术相结合,通过六个不同的亚细胞组分来描绘整体蛋白质组和磷酸化蛋白质组的动态变化。研究人员通过进一步对体外HeLa细胞和体内小鼠组织中EGFR磷酸化信号转导的时空动态进行研究,通过EGF信号模型证明了这种方法的适用性。最后利用该方法研究细胞在其它刺激下所产生的胞内蛋白定位变化,揭示了核糖体蛋白在高张力和肌肉收缩反应中的细胞重定位。

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亚细胞分离和direct DIA数据采集工作流程

(图源:Martinez-Val A, et al., Nat Commun, 2021)


3、EMBO Mol Med(IF14.260):尿液蛋白组分析揭示帕金森疾病标志物

文献名称:Urinary proteome profiling for stratifying patients with familial Parkinson’s disease(2021)

作者信息:德国马普所Matthias Mann团队(全球顶尖蛋白组学研究团队之一)

组学技术:direct DIA蛋白质组

样本类型:尿液

研究内容:该研究运用基于direct DIA的质谱技术,对帕金森(PD)组和对照组的尿液样本进行蛋白质组学分析。结果显示,PD患者和健康对照组之间共鉴定出361个差异蛋白,并且发现LRRK2 G2019S突变个体存在溶酶体失调。结合机器学习,可对突变携带者的突变状态和疾病表现进行分类,其中VGF、ENPEP和其他PD相关蛋白是最具鉴别力的特征蛋白。综上所述,该研究验证了尿液蛋白质组学是发现PD中生物标志物和患者分层的宝贵策略。

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基于direct DIA的PD组与对照组尿液蛋白质组学分析

(图源:Virreira Winter S, et al., EMBO Mol Med, 2021)


4、Cell Rep Med(IF=16.988):脑脊液蛋白质组分析揭示帕金森疾病标志物

文献名称:Proteome profiling of cerebrospinal fluid reveals 

biomarker candidates for Parkinson’s disease(2022)

组学技术:direct DIA蛋白质组

样本类型:脑脊液

作者信息:德国马普所Matthias Mann团队

研究内容:该研究是Matthias Mann团队的又一力作。在这项研究中,Mann研究团队扩展了基于质谱的蛋白质组学工作流程,分析了PD组与对照组的脑脊液样本,从微量样本中重复量化超过1700种蛋白质,通过机器学习确定了LRRK2 G2019S携带者特有的生物标志物特征。与团队之前进行的尿液蛋白质组研究结果进行比较,发现在两种体液中都可以识别出相似的PD和LRRK2相关的蛋白质组变化,为理解PD发病机制提供了新途径,以进一步寻找潜在生物标志物。

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基于direct DIA的脑脊液蛋白组分析

(图源:Karayel O, et al., Cell Rep Med, 2022)


5、Nature(IF69.504):多组学方法揭示冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV的分子机制

文献名称:Multilevel proteomics reveals host perturbations 

by SARS-CoV-2 and SARS-CoV(2021)

作者信息:蛋白质组学资深教授Matthias Mann、慕尼黑工业大学的病毒免疫病理学主席Andreas Pichlmair教授团队

组学技术:direct DIA蛋白质组,泛素化修饰组和磷酸化修饰组

样本类型:SARS-CoV-2,SARS-CoV,人肺源性细胞系

研究内容:该研究利用质谱技术,对SARS-CoV-2和SARS-CoV进行蛋白质组、转录组、泛素化及磷酸化修饰组学研究。研究人员系统地检测了1200多个细胞感染SARS-CoV-2和SARS-CoV前后的蛋白质功能变化,发现了1484个病毒蛋白质与宿主蛋白质之间的相互作用,1000多个发生变化的泛素化位点和4600多个发生变化的磷酸化位点,揭示了SARS-CoV-2和SARS-CoV感染造成的细胞之间的交叉串扰,并识别出冠状病毒的独特及共同的分子机制,从而筛选冠状病毒潜在的药物靶点,指导候选药物的开发。

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SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒蛋白的磷酸化和泛素化

(图源:Stukalov A, et al., Nature, 2021)


6、Anal Chem(IF8.008):direct DIA极大地提高了蛋白质组学的深度、范围和完整性

文献名称:BoxCar and Library-Free Data-Independent 

Acquisition Substantially Improve the Depth, Range, and 

Completeness of Label-Free Quantitative Proteomics(2022)

作者信息:加拿大Alberta大学R Glen Uhrig团队

组学技术:direct DIA蛋白质组

样本类型:Hela细胞,拟南芥细胞

研究内容:该研究通过对Hela细胞、拟南芥细胞进行蛋白质组学研究,提出了一种新的direct DIA方法,并与DDA进行比较,证明了相较于DDA,direct DIA蛋白质鉴定更多、更准确、更可靠。同时发现DDA对低丰度蛋白定量的结果不一致,缺失值较多且重复性较差。研究人员还应用direct DIA对光和暗处生长的拟南芥细胞培养物进行了定量蛋白质组学比较,发现光处生长细胞比暗处生长细胞中缺失值的比例更大。总而言之,研究证明了direct DIA的几个优点,并为在植物中广泛采用direct DIA进行蛋白组学研究提供了可靠的结果。

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不同光照下拟南芥细胞蛋白质丰度差异分析

(图源:Mehta D, et al., Anal Chem, 2022)

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拜谱生物超高深度DIA·磷酸化修饰组采用全球独创的富集技术+全息扫描,无差别的采集质谱扫描范围内所有信号,并且使用direct DIA技术,无需DDA分级建库,利用深度机器学习解决数据分析的难题,具有高深度、高稳定性、高效流程的特点,可广泛应用于植物与动物的细胞、组织等的测定中,为深度挖掘数据潜在信息提供了可能性,从而更好地解释表型背后的分子机制及因果关系,助力高分文章发表。



参考文献:

[1] Bekker-Jensen DB, Bernhardt OM, Hogrebe A, et al. Rapid and 

site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries. Nat Commun

2020;11(1):787. Published 2020 Feb 7. doi:10.1038/s41467-020-14609-1.

[2] Martinez-Val A, Bekker-Jensen DB, Steigerwald S, et al. 

Spatial-proteomics reveals phospho-signaling dynamics at subcellular resolution. Nat Commun. 2021;12(1):7113. Published 2021 Dec 7. doi:10.1038/s41467-021-27398-y.

[3] Virreira Winter S, Karayel O, Strauss MT, et al. Urinary 

proteome profiling for stratifying patients with familial Parkinson's 

disease. EMBO Mol Med. 2021;13(3):e13257. doi:10.15252/emmm.202013257.

[4] Karayel O, Virreira Winter S, Padmanabhan S, et al. Proteome 

profiling of cerebrospinal fluid reveals biomarker candidates for 

Parkinson's disease. Cell Rep Med. 2022;3(6):100661. doi:10.1016/j.xcrm.2022.100661.

[5] Stukalov A, Girault V, Grass V, et al. Multilevel proteomics 

reveals host perturbations by SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Nature. 2021;594(7862):246-252. doi:10.1038/s41586-021-03493-4.

[6] Mehta D, Scandola S, Uhrig RG. BoxCar and Library-Free Data-

Independent Acquisition Substantially Improve the Depth, Range, 

and Completeness of Label-Free Quantitative Proteomics. Anal 

Chem. 2022;94(2):793-802. doi:10.1021/acs.analchem.1c03338.

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