案例文章|IF=10.323华中农业大学刘继红教授团队New Phytologist发刊,磷酸化修饰组学多胺积累的分子机制研究

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      精氨酸脱羧酶(ADC)介导的腐胺(Put)生物合成在植物非生物胁迫反应中起着重要作用。SnRK2(SNF1-related protein kinases 2s)和ABF(ABA-response element (ABRE) binding factors)是参与干旱胁迫响应的ABA信号通路的核心组成部分。团队前期研究发现枳(Poncirus trifoliata)PtrADC在抗旱性方面的作用。然而,在干旱胁迫下,SnRK2和ABF是否以及如何调节PtrADC以调控腐胺积累仍不清楚。

      华中农业大学刘继红教授团队在植物学权威期刊“New Phytologist”上发表了题为“SnRK2.4-mediated phosphorylation of ABF2 regulatesARGININE DECARBOXYLASE expression and putrescine accumulation under drought stress”的文章,该研究采用一系列生理、生化和分子方法,揭示了由PtrSnRK2.4和PtrABF2组成的蛋白质复合物通过直接调节PtrADC来调节腐胺的生物合成和植物耐旱性。
       在此研究中,拜谱生物提供了磷酸化修饰组学技术,在SnRK2.4与PtrABF2相互作用并使其磷酸化实验中进行体内磷酸化与磷酸化位点的检测,助力抗干旱胁迫分子调控机制研究。

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SnRK2.4-mediated phosphorylation of ABF2 regulatesARGININE DECARBOXYLASE expression and putrescine accumulation under drought stress
中文题目:SnRK2.4介导ABF2磷酸化调节干旱胁迫下精氨酸脱羧酶表达和腐胺积累
期刊:New Phytologist
影响因子:10.323
发表时间:2022年10月9日
拜谱提供服务:磷酸化修饰组学
作者信息:华中农业大学园艺林学院刘继红教授为论文通讯作者,宋杰为论文第一作者
作者单位:华中农业大学园艺林学院园艺植物生物学教育部重点实验室


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结果展示

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1. PtrABF2通过直接结合其启动子来调控PtrADC


团队先前的研究表明PtrADC在抗旱性中的作用。在本次研究中,通过Y1H鉴定调控PtrADC的上游转录因子,鉴定到PtrABF2和PtrNAC72两个基因。根据文献报道,PtrNAC72是PtrADC的负调节因子,所以首先对PtrABF2进一步研究。Y1H和EMSA实验表明PtrABF2可在体外直接与PtrADC结合(图1 a~c)。

ChIP-qPCR分析结果显示PtrABF2在体内通过PtrADC启动子中的ABRE元件与pADC结合(图1 a,d)。烟草双LUC报告基因检测表明效应子和含有p1启动子片段的共浸润导致启动子活性显著升高,荧光信号更强;当P1突变时,启动子活性恢复到对照水平(图1e-g)。

这些结果有力地证明了PtrABF2直接与PtrADC启动子结合,并通过转录激活其表达。

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图1

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2. PtrABF2是脱水诱导基因


在正常条件下生长的植物中,PtrABF2转录水平较低,几乎无变化,但随脱水时间的增长而逐渐上调,在9h达到峰值。然而,在脱水处理前加入氟啶酮可显著抑制PtrABF2的上调(图2a),提示脱水诱导PtrABF2是ABA依赖性的。此外,外源ABA处理后,PtrABF2的表达水平在9小时内逐渐升高(图2b)。经脱水处理后,枳中的腐胺含量在12时达到最高水平(图2c)。

这些结果表明,PtrABF2主要是由脱水和ABA处理诱导的。

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图2

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3. PtrABF2起转录因子作用


为了确定PtrABF2的亚细胞定位,在烟草表皮细胞中进行了35S:PtrABF2-YFP的瞬时表达。结果显示,35S:PtrABF2-YFP与VirD2NLS-mCherry在细胞核中共定位(图3 a),提示PtrABF2是一种核蛋白。使用酵母细胞检测PtrABF2是否具有转录激活活性。实验表明,含N末端和全长结构区域的酵母细胞在选择培养基上生长正常,并具有半乳糖苷酶活性(图3 b, c),表明N末端区域负责PtrABF2的转录活性。
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图3

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4. PtrABF2通过促进腐胺合成提高其抗旱性


野生型柠檬(WT)和PtrABF2过表达的转基因柠檬干旱处理,然后浇水恢复生长,与WT相比,转基因品系表现出较好的生长状态,叶片萎蔫和坏死较少,叶绿素荧光更强(图4 a, b);EL、MDA、H2O2和O2-含量较低,Fv/Fm值较高(图4 c-f)。正常生长条件下,WT中的ADC活性和腐胺含量与转基因植物之间几乎没有差异,但在干旱处理之后,显著低于转基因品系(图4 g, h)。
所有这些数据表明,PtrABF2过表达显著增强了转基因植物的耐旱性,促进干旱胁迫下的腐胺积累。
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图4

为了进一步研究PtrABF2在耐旱性和腐胺合成中的作用,利用VIGS法构建PtrSnRK2.4沉默株系。在正常生长条件下,两种植株之间的形态没有明显的差异。然而,在干旱胁迫下,与TRV对照相比,VIGS植株表现出更严重的叶片枯萎,叶绿素荧光变弱和Fv/Fm值的降低(图5 a);EL、MDA、H2O2和O2-水平升高(图5 b-d)。与TRV对照相比,在正常生长条件下,VIGS植株的ADC基因表达、ADC活性和腐胺水平略有下降,但在干旱胁迫下水平显著下降(图5 e-g)。这些结果表明PtrABF2的沉默抑制了腐胺的合成并提高了对干旱的敏感性。随后在干旱胁迫前用10 mm腐胺对VIGS植株进行预处理,以水处理作为对照来研究外源腐胺是否能恢复VIGS株系的抗旱性。在干旱处理后,腐胺预处理的植株比水处理的植株表现出更少的叶片萎蔫和更强的叶绿素荧光,以及更高的Fv/Fm值(图5 h)。此外,腐胺预处理的植株中EL、MDA、ROS、H2O2和O2-的水平更低(图5 i-k)。在干旱胁迫下,添加腐胺的植株内源腐胺水平显著高于水处理的植株(图5 l)。

这些结果表明,外源腐胺在一定程度上恢复了VIGS品系的耐旱性,表明腐胺积累参与了PtrABF2介导的抗旱性。

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图5

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5. SnRK2.4与PtrABF2相互作用并使其磷酸化


先前的研究表明,SnRK2以ABA依赖的方式磷酸化ABFs。枳的7个SnRK2成员中,只有PtrSnRK2.4在脱水和ABA处理下的上调幅度最大,其表达模式与PtrABF2一致。酵母双杂交实验表明,PtrSnRK2.4与PtrABF2的N端相互作用(图6 a)。BiFC实验表明,这两种蛋白在烟草叶片的细胞核中相互作用(图6 b);GST-pull down分析进一步验证了PtrSnRK2.4和PtrABF2之间的体外相互作用(图6 c);LCI分析进一步确定这些蛋白质在烟草叶片中的相互作用(图6 d)。这些结果有力地表明,PtrSnRK2.4与PtrABF2可以形成蛋白质复合体。
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图6

由于PtrSnRK2.4和PtrABF2之间的相互作用,作者研究了PtrSnRK2.4是否以及如何磷酸化PtrABF2。体内磷酸化检测和体外激酶实验表明,PtrSnRK2.4对PtrABF2有磷酸化作用(图7 a, b)。LC-MS/MS分析表明,PtrABF2的第93位丝氨酸残基(Ser93)是一个潜在的磷酸化位点(图7 c),将此位点突变后,无论是在体外还是体内,PtrABF2均未被PtrSnRK2.4磷酸化(图7 d, e)。这些结果表明PtrABF2的Ser93位点是PtrSnRK2.4磷酸化的真正靶点。
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图7
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6、 PtrABF2的磷酸化对PtrADC的转录调控至关重要


为了探讨PtrSnRK2.4介导的PtrABF2磷酸化的意义,进行双LUC实验。检测结果表明,与单独表达PtrABF2相比,当PtrSnRK2.4与PtrABF2在烟草叶片中共同表达时,启动子活性显著提高(图8 a-c),然而,PtrABF2的S93A突变完全消除了对启动子活性的诱导(图8 d,e)。这些结果表明PtrSnRK2.4介导的Ser93位点磷酸化对PtrABF2的转录激活是至关重要的。与对照组相比,过表达PtrABF2S93A-GFP的转基因愈伤组织的ADC表达水平、ADC活性和腐胺含量显著升高,而过表达PtrABF2S93A-GFP的愈伤组织则没有显著差异(图8 f, g)。此外,在有无HA-PtrSnRK2.4的情况下,PtrABF2-GFP和PtrABF2S93A-GFP均被渗透到烟草叶片中,以进一步探讨PtrABF2磷酸化对ADC调节的影响。共表达PtrABF2和PtrSnRK2.4的叶片中ADC活性显著高于仅表达PtrABF2的叶片。相反,无论是否存在PtrSnRK2.4,表达PtrABF2S93A的叶片中的ADC活性和腐胺含量与对照组相比几乎没有差别(图8 h)。EMSA法检测PtrSnRK2.4介导的磷酸化是否影响PtrABF2与pADC的相互作用。结果显示PtrSnRK2.4以剂量依赖性的方式促进PtrABF2结合到启动子片段,同时,PtrABF2的S93A突变抑制了其与pADC的结合(图8 i)。
总之,这些结果表明,PtrSnRK2.4介导的PtrABF2磷酸化促进了PtrADC的转录调控。
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图8

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7. PtrSnRK2.4通过调节腐胺积累在耐旱性中发挥积极作用


为了探讨PtrSnRK2.4在耐旱性中的作用,通过农杆菌介导法获得了高表达PtrSnRK2.4的转基因柠檬品系,其中内源ABF2和ADC的mRNA水平显著高于WT。在正常条件下,WT与转基因植株在形态上无明显差异;在干旱条件下,转基因植株表现出严重的叶片萎蔫,而转基因植株仍保持良好的生长和叶片膨大(图9 a)。在干旱胁迫下转基因植物的EL、MDA和ROS水平更低,叶绿素荧光和Fv/Fm值更高(图9 b-f);ADC活性和内源腐胺水平也显著高于WT(图9 g-h)。


案例文章|IF=10.323华中农业大学刘继红教授团队New Phytologist发刊,磷酸化修饰组学多胺积累的分子机制研究  图9

为了进一步揭示PtrSnRK2.4在抗旱性中的作用,利用VIGS法构建PtrSnRK2.4沉默株系,PtrABF2和PtrADC在其中明显下调。在干旱处理下,与TRV对照相比,VIGS植株表现出更严重的干旱诱导症状,如叶片萎蔫和黄化(图10a)。与表型一致,在干旱胁迫下,VIGS植物中的EL、MDA和ROS水平显著更高,叶绿素荧光和Fv/Fm值降低(图10b-f)。此外,与TRV对照相比,VIGS品系的内源腐胺含量在正常的情况下略有下降,而在干旱处理下显著降低(图10g)。有趣的是,外源腐胺可以有效缓解VIGS植物由于干旱造成的伤害。

这些结果表明,PtrSnRK2.4通过调节腐胺的积累而在抗旱性中发挥积极作用。

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图10


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总结

Summary

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综上所述,该研究对干旱胁迫下负责腐胺积累的调控模块SnRK2.4-ABF2-ADC有了新的认识,阐述了PtrABF2在干旱胁迫下的转录调控机制,以及上游蛋白激酶PtrSnRK2.4磷酸化PtrABF2介导植物腐胺合成与积累过程中的重要作用,从而促进了我们对腐胺合成转录调控以响应非生物胁迫的转录调控的分子机制的理解。

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图11


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技术学习

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参考文献:Song J, Liu JH. SnRK2.4-mediated phosphorylation of ABF2 regulates ARGININE DECARBOXYLASE expression and putrescine accumulation under drought stress.New Phytol. 2022 Oct 9.

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