致谢文章 IF=12.779|南京大学医学院蒋青教授团队在PNAS上发文,拜谱生物蛋白质组学助力DDH分子机制研究!


       发育性髋关节发育不良(Developmental dysplasia of the hip,DDH)是一种常见的髋部先天性畸形,其主要特征为髋臼发育不良,由于患者的股骨头与髋臼形状不匹配,导致髋关节活动受限和过早退变。

       先前的研究通过病例对照和全基因组关联研究确定了许多DDH候选基因和易感位点。然而,很少有关联位点能够在独立人群中被验证。目前已有研究报道一些DDH患者表现出常染色体显性遗传,但其致病基因尚不清楚。

2022年9月6日,南京大学医学院蒋青教授团队在国际顶级医学期刊《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上在线发表了一篇题为“Heterozygous LRP1 deficiency causes developmental dysplasia of the hip by impairing triradiate chondrocytes differentiation due to inhibition of autophagy”的文章。该研究通过对家系和散发的DDH患者进行全外显子测序发现LRP1突变位点,并发现LRP1基因缺陷通过抑制自噬,异常激活Y形软骨细胞中Wnt/β-catenin信号,阻遏了软骨发育,最终导致DDH的发生。在此研究中,拜谱生物提供了iTRAQ蛋白质组学技术,在Lrp1缺陷小鼠成软骨能力下降和抑制自噬实验中进行蛋白定量,助力分子机制研究。


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Heterozygous LRP1 deficiency causes developmental dysplasia of the hip by impairing triradiate chondrocytes differentiation due to inhibition of autophagy杂合性LRP1缺陷通过抑制自噬影响Y形软骨分化导致发育性髋关节发育不良

期刊:PNAS

影响因子: 12.779

发表时间: 2022年9月6日

拜谱提供服务: iTRAQ蛋白质组学

研究对象: 小鼠软骨细胞

作者信息: 南京大学医学院蒋青教授、郭保生副教授为文章的共同通讯作者,南京大学医学院附属鼓楼医院严文津博士和南京大学医学院博士生郑力铭为该文章的共同第一作者。
作者单位: 南京大学医学院、南京大学医学院附属鼓楼医院


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研究内容

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1.DDH患者LRP1基因突变的鉴定

对8个家系的17名DDH患者进行全外显子测序,发现两个罕见的LRP1基因杂合变异,c.5347C > T [p.R1783W]和c. 6386C>A[p.T2129K]。对68名散发DDH患者进行LRP1靶向测序,鉴定出8个罕见的变异,包含5个错义变异和3个剪接位点变异(图1、表1)。

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图一


2.Lrp1R1783W是LoF等位基因

小鼠模型:CRISPR-Cas9编辑技术构建Lrp1 KI小鼠(Lrp1R1783W/+、Lrp1R1783W/R1783W )、Lrp1 KO小鼠(Lrp1+/-)小鼠。
Western blot和蛋白质谱:LRP1蛋白表达水平在Lrp1R1783W/+、Lrp1R1783W/R1783W、Lrp1+/-小鼠中显著降低。KI杂合子的表达水平介于野生(WT)和KI纯合子小鼠之间,KI纯合子小鼠的表达水平与KO小鼠相似。
结果表明,LRP1 c.5347C > T可以通过基因剂量效应引起LRP1 LoF。




3. Lrp1缺陷小鼠表现出DDH表型
为了评估LRP1在髋关节发育中的功能,在4周、8周和16周检测了Lrp1 KI和KO小鼠的髋关节表型。
Micro-CT:纯合子和杂合子KI小鼠以及杂合子KO小鼠髋臼体积显著减小。小鼠髋臼显示股骨头覆盖有缺陷(图2 A、B)。突变小鼠的髋臼体积与Lrp1的表达水平一致:杂合子KI小鼠的体积大于纯合子KI小鼠体积,小于WT小鼠体积,与KI纯合子小鼠体积相近。
结果表明,杂合KI、KO小鼠均表现出DDH表型。
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图二


4.Lrp1缺陷小鼠的Y形软骨更早闭合

组织学:纯合子KI和杂合子KI小鼠与WT小鼠的髋臼图像大体相似,但是髋臼软骨较WT小鼠更稀疏;KI和KO小鼠的未矿化软骨面积较WT小鼠显著减少(图3 A、B)。

Y形软骨闭合时间:KI和KO小鼠Y形软骨在6周前已完全闭合,而WT小鼠在8周后完全闭合(图3 C)。这一发现与Micro-CT测量髋臼体积的结果一致

髋臼面积和软骨厚度:Lrp1+/−小鼠和KI小鼠的髋臼面积和软骨面积明显小于WT小鼠(图3 D、E)。

根据以上观察结果,推测LRP1缺陷可能导致Y形软骨的过早融合,从而抑制Y形软骨双向生长,导致髋臼缩小(图3 F)。


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图三


5. Lrp1+/-骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨能力下降

iTRAQ蛋白质组:Lrp1R1783W杂合子和纯合子Lrp1R1783W小鼠髋关节胶原蛋白表达均显著低于WT小鼠;自噬相关蛋白质Fis1和p62都显著增加,并呈现剂量效应(图4 A)。

阿尔辛蓝染色:随着时间的推移,基质蛋白多糖合成结节的强度逐渐增加,杂合子KO小鼠的结节比WT小鼠少(图4 B)。

qPCR和Western blot:在WT和杂合子KO小鼠中,软骨细胞早期分化标记物Sox9的表达在第7~14天显著增加,而Lrp1+/−小鼠表达水平远低于WT小鼠(图4 C~E)。

3D软骨结构:体外实验检测LRP1缺陷对3D软骨结构的影响,WT和Lrp1+/-BMSCs都形成3D球团,但Lrp1+/-BMSCs球团显著减小。染色显示Lrp1+/−球团内部有空洞,而WT显示染色均匀(图4 F)。

结果表明,Lrp1 KI和KO小鼠BMSCs的软骨分化标志物检测证实早期软骨细胞分化受到阻碍,其成软骨能力下降,导致Y形软骨早期闭合,最终表现为髋臼较小。


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    • 图四


    6.LRP1缺乏抑制β-catenin的自噬降解
    为了探索LRP1在软骨发育中作用的分子机制,采用shRNA-Lrp1慢病毒转染建立ATDC5多克隆细胞系。
    iTRAQ蛋白质组和Western blot:与动物实验结果一致,shRNA-Lrp1细胞中软骨分化标志物的表达显著下降(图5 A);β-catenin在sgRNA-Lrp1细胞中具有显著的上调(图5 A、B);上游自噬蛋白Beclin1、Fis1和Perk在shRNA-Lrp1细胞中明显上调,而mTor、Akt、Erk及其磷酸化水平显著上调(图5 B、C);自噬体晚期形成的标志物LC3II/I显著减少,而p62显著增加。显然,p62的积累表明自噬小体无法形成(图5 C)。
    电子显微镜:ATDC5中自噬体具有独特的双层结构,而在shRNA-Lrp1细胞中观察到的自噬小体较少。(图5 D)此外,LC3B染色也表明shRNA-Lrp1细胞自噬水平降低(图5 E)。
    这些结果表明,自噬体的形成需要Lrp1。
    与此同时,团队严谨的考虑到β-catenin在成软骨分化中的重要作用及其在shRNA-Lrp1细胞中的显著增加,作者测试了Lrp1、β-catenin和自噬(LC3)之间的关系。对4周大小鼠(杂合子和纯合子KI、Lrp1+/-小鼠及其WT同胎小鼠)髋关节切片进行免疫荧光染色,结果显示,LC3B和β-catenin共定位,β-catenin持续增加,LC3B水平下降(图5 H)。
    综上所述,LRP1缺陷会抑制β-catenin的自噬降解。
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    图五



    7.抑制β-catenin可缓解ATDC5中由LRP1缺陷引起的软骨形成能力下降
    PNU(β-catenin拮抗剂)抑制TCF4和β-catenin在细胞核内的相互作用,在shRNA-Lrp1 ATDC5细胞中检测了PNU对软骨细胞分化的影响。
    Western blot:shRNA-Lrp1细胞中的β-catenin水平明显上调,PNU治疗以剂量依赖的方式下调(图6 A、B)。与shRNA-NC细胞相比,shRNA-Lrp1细胞的总蛋白聚糖显著下降(图6 C)。PNU治疗导致蛋白聚糖(图6 C)、Col2和Sox9(图6 D)显著增加。PNU导致细胞核和细胞质中的β-catenin水平下降,但在细胞核中β-catenin水平下降更明显(图6 E),这与先前的研究一致,即PNU可以通过直接与肾上腺细胞系(NCI-H295)中的β-catenin结合,直接降低β-catenin的表达。
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    图六


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    总结

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    在LRP1基因致病的分子作用机制研究中,利用iTRAQ蛋白质组学对蛋白进行定量,发现LRP1基因缺陷导致自噬小体形成受阻,异常激活Y形软骨细胞中Wnt/β-catenin信号,阻遏了软骨发育,最终导致DDH的发生。LRP1基因在DDH的病因和发病机制中关键作用的发现,为DDH的早期诊断和治疗提供了潜在的干预的方案。


    参考文献:

    Yan W, Zheng L, Xu X, Hao Z, Zhang Y, Lu J, Sun Z, Dai J, Shi D, Guo B, Jiang Q. Heterozygous LRP1 deficiency causes developmental dysplasia of the hip by impairing triradiate chondrocytes differentiation due to inhibition of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Sep 13;119(37):e2203557119. doi: 10.1073/pnas.2203557119. Epub 2022 Sep 6. PMID: 36067312; PMCID: PMC9477389.


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