非洲猪瘟病毒(ASFV)具有一段170 ~ 190kb的双链DNA分子，表达超过150个蛋白质，在病毒复制、病毒与宿主的相互作用和免疫逃逸中发挥重要作用。在中国，2018年辽宁省报道了首例ASFV感染病例，其特点是脾明显增大，猪全身性出血。随后，中国多个省份报告了ASFV感染病例。ASFV已威胁到中国50%以上的家猪种群，造成严重的经济损失。截至目前，中国的ASFV分离株大部分属于基因型II。先天免疫反应是宿主抵抗病毒感染的第一道防线。病毒也负调节宿主先天免疫反应以促进自我复制。为了促进病毒在宿主细胞内的复制，病毒可以夺取细胞器合成大量病毒复制所需的代谢物。了解病毒感染对宿主细胞代谢的影响将促进对致病机制的认识，有助于针对代谢提出新的预防措施。
代谢组学是一种新的方法，用来识别癌症和其他疾病中特殊小分子，已经广泛应用于动物、人类和植物的生物学研究中。ASFV感染可控制cGAS-STING通路，调控IFN-β的产生。研究表明，ASFV的一些蛋白通过不同的方式抑制宿主先天免疫反应，促进病毒复制。然而，ASFV与宿主细胞代谢相互作用的内在机制仍不清楚。
近日，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究团队在《Journal of virology》中发表了一篇题为“African swine fever virus regulates host energy and amino acid metabolism to promote viral replication”的文章。在该研究中，收集了ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）进行代谢组学分析，包括靶向能量代谢和氨基酸代谢组。该研究确定了ASFV抑制宿主先天免疫应答的新机制，并将为开发靶向代谢途径的新的预防或治疗策略提供见解。
African swine fever virus regulates host energy and amino acid metabolism to promote viral replication
中文题目：非洲猪瘟病毒通过调节宿主能量和氨基酸代谢促进病毒复制
期刊：Journal of virology
影响因子：5.103
发表时间：2021年12月15日
作者单位：中国农业科学院兰州兽医研究所
样品类型：猪肺泡巨噬细胞
拜谱生物提供服务：靶向能量代谢和氨基酸代谢组
首先确认ASFV在PAMs中的复制：随着感染的进展，病毒滴度显著升高，24 h和48 h感染后 (hpi)无明显差异，说明24 hpi后病毒生长几乎达到饱和，显示出很高的感染率；Western blotting检测P30蛋白表达量，P30蛋白也随时间增加。这些结果表明ASFV在PAMs中成功复制；为了进一步评估细胞在ASFV感染过程中的状态，采用< name='OLE_LINK4' style='background-image: url('https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/PbCWEMk8tdKkEzYibzpDPZxWdIWQjG2eMibzII3qaClZvvvUnXHTt0a9cIrcicgG4Aj9px7MoEMl9ZvJKkKEjSN4g/640?wx_fmt=gif');word-break: break-all !important;'>末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)方法检测细胞凋亡，细胞凋亡率随感染进展显著增加，在48 hpi时超过95%的细胞发生凋亡。
检测PAMs中的ASFV复制
随后进行代谢组学检测：分组包括空白对照\6h\12h\24h\。根据二级谱图数据库和KEGG化合物数据库匹配到302 (POS)和185 (NEG)个代谢产物的有效峰。然后进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS - DA)，空白对照和3个时间点感染组的OPLS‐DA结果如下图所示，结果表明感染模型是可靠的、稳定的。
空白对照和3个时间点ASFV感染（6h、12h、24h）细胞的OPLS DA模型
在ASFV感染后PAMs中的代谢产物发生了显著变化
差异代谢物以火山图的形式显示，每个点代表一个代谢物。图中显示了倍数变化（FC）＞1.5或< 0.67同时Student’s T检验的p值< 0.05的代谢物。
火山图
感染ASFV后，90个代谢物发生显著变化，相对于空白对照，有65个代谢物显著上调，25个代谢物显著下调；接下来层次聚类热图展示显著差异代谢物，随着时间的推移，上调代谢产物的数量逐渐增加，许多氨基酸的表达增加了，表明与氨基酸代谢有关。综上所述，这些结果表明ASFV感染诱导了代谢产物的显著变化。
代谢物层次聚类热图
利用KEGG和MetaboAnalyst对猪的对应通路数据库进行检索，并进一步确定与差异代谢物相关的通路。结果以气泡图表示。在ASFV感染过程中存在许多代谢途径的改变。ASFV感染过程中差异代谢物的富集通路主要包括氨酰- tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸生物合成，氨基酸生物合成和蛋白质消化吸收。
通路富集气泡图
最终获得了感染ASFV的PAMs的代谢产物变化的详细谱图。在6 hpi时，较少代谢物受到影响，包括组氨酸、UMP和谷氨酰胺。24 hpi时，组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和乳酸水平显著上调，与病毒复制过程一致。与此同时，磷酸胆碱水平显著下调。总的来说，ASFV感染显著影响了氨基酸代谢，这使得氨基酸在ASFV感染过程中的许多关键代谢途径中发挥重要作用。
感染ASFV的PAMs中代谢途径变化的示意图
氨基酸是一种重要的底物，对细胞代谢和增殖至关重要。为进一步分析ASFV感染过程中氨基酸代谢的变化，对ASFV感染不同时间点的氨基酸含量进行了定量分析：使用UHPLC-MS检测代谢物的离子峰面积，然后检测值与标准品相比。在24hpi时，许多氨基酸在ASFV感染的细胞中升高，包括天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、赖氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。其余氨基酸水平保持不变或下降。非靶向和靶向结果均显示ASFV感染后天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸水平显著升高。这三个上调的氨基酸可能在ASFV复制中发挥重要作用。在48 hpi时，除胱氨酸外，ASFV感染细胞的所有氨基酸均下调。结果表明，ASFV在感染早期诱导了氨基酸的增加，促进了病毒的复制；然而，在感染后期，ASFV消耗尽了细胞氨基酸，导致氨基酸减少。
ASFV感染调节的氨基酸代谢
氨基酸代谢一直与能量代谢有关。因此，我们进一步分析了ASFV感染过程中糖酵解和TCA循环的变化。果糖6-磷酸显著下调，丙酮酸显著上调。对于TCA循环，鉴定了一些重要的代谢产物，表明ASFV感染诱导了柠檬酸和琥珀酸的升高。α-酮戊二酸和草酰乙酸进一步测定，结果显示，随着ASFV感染的进展，α-酮戊二酸、α-酮戊二酸脱氢酶和草酰乙酸的表达量显著上调。提示ASFV感染对TCA循环代谢产物有显著影响。天冬氨酸氨基转移酶(AST)是一种依赖维生素B6的酶，能促进天冬氨酸和α-酮戊二酸相互转化为草酰乙酸和谷氨酸。在ASFV感染的细胞和猪中检测AST活性，以确定天冬氨酸与TCA循环的关系。结果显示，随着感染的进展，PAMs中的AST活性显著增强。猪血清中AST活性也显著升高。同时，在细胞和血清中，谷氨酸的含量都有所增加。综上所述，ASFV感染促进了TCA循环，导致TCA循环与氨基酸合成之间的可逆转变。TCA循环和氨基酸的增加可能与ASFV的复制和致病性有关。
ASFV感染促进细胞能量代谢
进一步检测了天冬氨酸、谷氨酸、和TCA循环对ASFV复制的影响。酪氨酸磷酸化抑制剂23(T23)是一种著名的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，T23处理后，线粒体TCA循环强烈加速。因此，接下来使用T23促进TCA循环。将培养的PAMs用ASFV感染(MOI 1)，然后与增加浓度的天冬氨酸、谷氨酸、α-酮戊二酸或T23孵育24 h，采用HAD50法测定病毒滴度。结果显示天冬氨酸或T23处理组显著促进ASFV复制，且呈剂量依赖性。25 mg/L谷氨酸或α-酮戊二酸处理不影响ASFV复制，而50 mg/L处理显著促进了ASFV复制。上述结果表明，细胞TCA循环、天冬氨酸和谷氨酸在ASFV复制中发挥了重要作用。
天冬氨酸、谷氨酸和TCA循环促进ASFV复制
为确定ASFV感染对乳酸水平的影响，检测ASFV感染过程中乳酸的表达。结果显示，随着感染的进展，乳酸水平显著增强。UK-5099是线粒体丙酮酸转运体的抑制剂，抑制丙酮酸依赖的氧气消耗，促进乳酸生成。图中显示，与空白对照相比，UK-5099培养的细胞乳酸水平显著升高，导致ASFV诱导的IFN-β表达降低，ASFV复制增加。GSK2837808A(GSK)是一种乳酸脱氢酶(LDH)的强效特异性抑制剂，可以抑制乳酸的生成。与UK-5099相比，GSK诱导的乳酸水平低表达，导致ASFV诱导的IFN-β高表达，ASFV复制减少。ASFV感染也提高了LDH的活性，这可能直接导致乳酸的增加。
用RIG-I和NC siRNA转染PAMs，然后感染ASFV (MOI 1)，发现RIG-I siRNA细胞中IFN-β蛋白的分泌较NC siRNA细胞明显减少，ASFV复制水平显著增强。Western blotting证实了RIG-I蛋白表达。总之，这些结果表明，ASFV感染引起的乳酸水平升高，导致IFN-β表达下降，ASFV复制增加，揭示了ASFV对抗宿主先天免疫应答的一种新机制。这是首次报道RIG-I参与ASFV诱导的IFN-β激活。
ASFV感染增加乳酸产生，进而促进病毒复制
本研究第一次分析了ASFV感染的PAMs细胞的代谢组学特征。ASFV感染改变了宿主体内和体外的能量代谢和氨基酸代谢。TCA循环、天冬氨酸和谷氨酸在ASFV复制中发挥重要作用。ASFV感染增强乳酸产生，抑制宿主IFN-β的表达 并促进病毒复制。RIG-I介导的信号通路参与ASFV诱导的IFN-β产生。该研究确定了ASFV利用的新型免疫逃逸机制，并对ASFV-宿主相互作用提供了观点，这对于设计ASFV靶向代谢途径的新预防策略至关重要。
ASFV感染调节宿主代谢的工作模型示意图
参考文献：Xue Q, Liu H, Zhu Z, Yang F, Song Y, Li Z, Xue Z, Cao W, Liu X, Zheng H. African swine fever virus regulates host energy and amino acid metabolism to promote viral replication. J Virol. 2021 Dec 15:JVI0191921. doi: 10.1128/JVI.01919-21. Epub ahead of print. PMID: 34908441.