国际TOP期刊《Analytical chemistry》项目文章|罕见领域发刊!基于蛋白质组学追溯古墓丝绸土壤印迹的成分和来源

       蚕丝是一种蛋白质材料,由于环境的影响,很容易老化和降解。根据丝绸文物出土状态,可分为物理丝织物、碳化丝织物、矿化丝织物和土样。碳化丝织物、矿化丝织物、土壤样品与物理丝织物不同,残留信息有限,但在青铜、土壤等介质中仍会残留一些物质信息。目前,蛋白质有机残留的鉴定方法主要有两种:蛋白质组学方法和免疫技术。蛋白质组学方法证实了文物样品中蛋白质的存在,如2500年前苏贝希墓地的面包,考古陶瓷碎片等。坟墓中的蛋白质来源复杂,包括人体蛋白质、微生物和动物纤维的降解产物,容易干扰对残留物的精细鉴别。蛋白质组学分析过程包括目标成分的溶解、提取、浓缩、酶解和质谱分析,目标成分的提取和浓度决定了质谱结果的准确性;抗原-抗体反应要求靶蛋白在反应前从古老的织物印迹或土壤中纯化或分离出来,织物印迹和土壤成分复杂,目标组分有效含量低。因此,从大量的考古标本中确定富集和提取目标蛋白的方法对实验的成功至关重要。

         2021年11月2日,浙江理工大学和中国丝绸博物馆科研团队在国际TOP期刊《Analytical chemistry》上发表了一篇题为“Rapid Enrichment and Detection of Silk Residues from Tombs by Double-Antibody Sandwich ELISA Based on Immunomagnetic Beads”的文章。该研究建立了一种古墓丝素蛋白的快速富集和检测方法:基于夹心酶联免疫吸附试验(夹心ELISA)检测和免疫磁珠(IMB)富集,随后用蛋白质组学进一步证实检测结果。在蚕丝残留样品(物理看不见的蚕丝)的鉴定中,免疫技术与蛋白质组学相结合,可以准确地鉴定其成分和来源。



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Rapid Enrichment and Detection of Silk Residues from Tombs by Double-Antibody Sandwich ELISA Based on Immunomagnetic Beads

期刊:Analytical chemistry

影响因子:6.986

中科院分区:1区

发表时间:2021.11.2

作者单位:浙江理工大学和中国丝绸博物馆科研团队

研究对象:古墓丝绸

拜谱生物提供服务:蛋白质组学

 


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技术路线





01


结果展示


1. 文物标本保存状态

样品I的表面为土壤,没有面料信息。样品II的表面清晰地显示出织物残留印痕,凹凸表面的印痕像平纹一样连续排列。



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文物样品的三维图像


 

印迹表面没有残留纤维,说明织物已经完全降解。




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苏家垄遗址88号墓的织物印迹的扫苗电镜(SEM)图像


 

图像的灰度对应物质的x射线吸收系数,根据吸收系数可以区分不同的相;这样,通过三维CT可以清楚地观察到不同相的组成。下图显示的印迹样品表面只有一个相,内部横断面结构显示相同的状态,这表明织物印迹的密度接近印迹下的土壤的密度。



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织物印迹的三维CT重建和绘制


 

总之,在这种状态下,传统的光谱分析方法和形态学方法不能再用来鉴别织物的纤维材料。

 

2. 配对抗体的敏感性

接下来进行配对抗体的双抗体夹心ELISA检测,以SF-1和bio-SF-3,SF-2和bio-SF-2,SF-3和bio-SF-1为最佳配对组。为评价三组配对抗体的敏感性,以蚕丝蛋白浓度为x轴,以OD450nm值为y轴进行曲线拟合分析。结果显示,SF1与bio-SF-3的回归方程的cutoff值为0.2625,极限浓度为27.215 ng/mL。SF-2与bio-SF-2的回归方程的cutoff值为0.334,极限浓度为68.845 ng/mL。SF-3与bio-SF-1的回归方程的cutoff值为0.529,极限浓度为10.425 ng/mL,该双抗体夹心ELISA的检测灵敏度最高,因此后续采用SF-3和bio-SF-1构建了免疫磁珠(IMB)双抗体夹心ELISA法。



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SF-1与bio-SF-3、SF-2与bio-SF-2、SF-3与bio-SF-1

双抗体夹心ELISA检测的拟合线


 

3. 用IMB-sELISA检测蚕丝蛋白的标准曲线

随着蚕丝蛋白浓度的增加,OD450nm逐渐增加,曲线呈“S”形。当浓度为10 ~ 104ng/mL时,蚕丝浓度与OD450nm呈良好的线性关系。在此范围内进行线性拟合,cutoff值为0.317,极限浓度为5.12 ng/mL。结果表明,该方法的检出限低于双抗体夹心ELISA的检出限,说明该方法能有效地浓缩蚕丝蛋白,有利于后续的检测。对模拟土壤样品中的蚕丝蛋白进行了IMB-sELISA检测。利用线性方程计算出土壤样品各组分中的蛋白含量。定量结果表明,当浓度为101、102、103和104ng/mL时,检测结果分别为9.33、89.11、843.72、7833.69 ng/mL。这说明IMB-sELISA法应用于土壤样品时,土壤中的杂质会导致其检测值低于实际值。这种差异也可能是由于蚕丝蛋白在土壤样品中结合在一起形成土壤有机团聚体,增加了蛋白质完全提取的难度。此外,土壤中的复杂杂质也会粘附在磁珠表面,导致蚕丝蛋白与IMB之间的结合位点减少。然而,这些影响因素对IMB-sELISA的灵敏度影响有限,在土壤样品中IMB-sELISA还是具有较高的灵敏度;将该方法应用于遗迹印迹样品和土壤样品,有望获得预期的结果。



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用免疫磁珠(IMB)-sELISA检测丝素蛋白的标准曲线


 

4. 遗迹样品的IMB-sELISA检测

将建立的IMB-sELISA方法应用于文物样品的检测。如下图所示,样品I和样品II的结果为阳性,说明两种土壤样品都残存蚕丝蛋白,根据线性方程计算出的浓度分别为8.02和9.20 ng/mL。结果表明,IMB双抗体夹心ELISA应用于土壤样品定性和定量分析是一种有效、简便的方法,优于其他化学方法,因为其他化学方法不能实现样品富集和检测同时进行。



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样品I和样品II的IMB-sELISA结果


 

5. 蛋白质组学分析

安吉汉墓土壤样品中检测出4种蚕丝蛋白,均为功能性蛋白。在苏家垄地区的纺织品印迹样品中检测到38种蚕丝蛋白,其中19种为功能性蛋白。根据检测结果,可以判断两件文物样品均含有丝蛋白。蚕丝的一种标志蛋白——P05790在两个样品中检测到,属于蚕丝重链蛋白。经证实,这两个样本中的蛋白来自于桑蚕丝,这表明两个墓里都有丝绸织物。综上,蛋白质组学分析结果与IMB-sELISA结果一致。蚕丝制品在埋藏环境湿度和微生物的影响下易降解。它们的降解不仅受埋藏时间的影响,而且与埋藏环境密切相关。安吉汉墓于2200多年前被封闭,苏家垄M88墓于3000多年前被封闭。安吉汉墓位于中国东南沿海,雨量充沛。陵墓被雨水渗透,处于半干半湿的状态,加速了丝绸等有机文物的老化和退化。因此,可以检测到的多肽数量明显少于苏家垄的M88墓。与现代丝绸蛋白质组学分析结果相比,两件文物样品中的蚕丝蛋白质均处于降解的最后阶段,重链、轻链和P25链均发生降解。因此,只有少数多肽分子被保留下来,并被土壤颗粒吸附。

 


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安吉汉代土壤样品中蛋白质的鉴定




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苏家垄纺织品印迹样品中蛋白质的鉴定


 



02


结论


检测考古学样品的主要挑战是,墓中可用的丝绸残留物含量很低,复杂的操作过程会导致蚕丝蛋白的流失。本文研制了一种基于IMBs的双抗体夹心ELISA方法,可快速富集检测墓葬中的蚕丝残留物。从墓葬中提取的印迹样品和土壤样品中均检测到蚕丝蛋白的残留,该方法计算的浓度与蛋白质组学分析结果一致。对于印迹样品特别是土壤样品中蚕丝残留物的检测,将免疫学方法与蛋白质组学技术相结合,可以保证检测结果的准确性。



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