研究背景

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是可能导致乳制品变质的主要污染物，该菌已被多个国家的奶粉生产企业作为主要的微生物污染物进行分离。在乳品生产过程中，这种细菌在管道和蒸发器等各种表面上附着并在不锈钢上形成生物膜的能力，进一步加剧了乳品工业面临的问题。但是对目前，生物膜形成的机理尚不清楚，其生物膜形成的调控机制待于进一步研究。

研究步骤

研究内容

该研究对膜形成组（bfm）,悬浮细胞组（blkt）和膜干预悬浮细胞组（plktlps）三组样本进行TMT-10标记，进行组间差异蛋白质分析，在bfm和plkt两组间，检测到491个表达差异的蛋白，其中上调蛋白238个，下调蛋白253个。在bfm和plktlps两组间，检测到890个表达差异的蛋白，其中上调蛋白453个，下调蛋白437个。

韦恩图显示了这四个组间的差异蛋白质的overlap情况。在bfm/plkt和bfm/plktlps均显著上调的蛋白质有221个。例如，由bioF编码的8-氨基-7-氧代纳米酸合成酶，由sodF编码的超氧化物歧化酶，由yqxM编码的分泌型生物膜形成蛋白有助于细菌生物膜基质的细胞成分。在bfm/plkt和bfm/plktlps均被显著下调蛋白质有223个。例如，由BL02467编码的厌氧核糖核苷三磷酸还原酶激活蛋白，其负责在厌氧条件下通过产生有机自由基激活厌氧核糖核苷三磷酸还原酶，以S-腺苷甲硫氨酸和还原黄素氧还蛋白为共底物产生5'-脱氧腺苷。

bfm/plktlps两组除了与bfm/plkt共同上调的蛋白外，还有231个蛋白质显著上调。例如，由yyxA编码的丝氨酸蛋白酶。在bfm/plktlps中，除了共同下调蛋白外，还有214个蛋白质被显著下调。例如，由purN编码的磷酸核糖基甘氨酸转移酶。bfm/plkt两组除了与bfm/plktlps共同上调蛋白外，还有17种蛋白质显著上调。例如，由cotZ编码的孢子外壳蛋白。除共同下调蛋白外，bfm/plkt中还有29种蛋白表达下调。例如，由pfkA编码的ATP依赖的6-磷酸果糖激酶。

图1. bfm/plkt的上调蛋白及下调蛋白，bfm/plktlps的上调蛋白及下调蛋白四部分的韦恩图。

接着，作者对差异蛋白质进行生物学过程（GO-BP），细胞成分（GO-CC）和细胞功能（GO-MF）富集。bfm/plkt差异蛋白质生物过程主要富集到有机氮化合物代谢、小分子代谢、蛋白质代谢、有机物分解代谢、单体分解代谢等过程中。bfm/plkt差异蛋白质细胞成分分析主要富集到细胞质、细胞器、胞内核糖核蛋白复合物部分。bfm/plkt差异蛋白质未显著富集到任何分子功能条目中。

bfm/plktlps差异蛋白质生物过程主要富集到有机氮化合物代谢、小分子代谢、蛋白质代谢、碳水化合物衍生物代谢、有机磷代谢，有机物分解代谢等过程。bfm/plktlps差异蛋白质细胞成分分析主要富集到细胞质和细胞器。分子功能分析主要富集在核苷结合、核苷酸结合、阴离子结合、连接酶活性等。

图2. 地衣芽孢杆菌生物膜形成及生物膜控制过程中差异表达蛋白质的GO富集分析。

bfm/plkt差异蛋白质的KEGG通路主要富集到糖酵解、糖异生、碳代谢、丁酸代谢、不同环境下微生物代谢、细菌趋化性。bfm/plktlps差异蛋白质的KEGG通路主要富集到香叶醇降解、抗生素生物合成、丙酮酸代谢、碳代谢、丙酸代谢。

图3. 地衣芽孢杆菌生物膜形成和生物膜控制过程中差异表达蛋白质的KEGG通路富集分析。

bfm/plkt和bfm/plktlps差异蛋白质的相互作用网络（PPI网络）主要涉及到能量代谢和生物膜形成代谢的几个关键途径，包括糖酵解/糖异生、碳代谢、不同环境下微生物代谢、细菌趋化性、鞭毛组装、柠檬酸循环、双组分系统、抗生素生物合成等。在细菌趋化、鞭毛装配和双组分系统中，生物膜相关蛋白在初级和次级代谢中与其他蛋白的相关性相对较小。双组分系统是基础代谢和生物膜代谢之间的纽带。在bfm/plktlps比较中，细菌趋化性和鞭毛装配途径的连接被切断。生物膜干预的结果也反映了细菌趋化性、鞭毛组装和双组分系统对生物膜形成的重要作用。

图4. 地衣芽孢杆菌生物膜形成过程中不同表达蛋白质的相互作用网络及生物膜控制。

总之，本研究通过TMT标记定量蛋白组学技术揭示了地衣芽孢杆菌生物膜形成和控制的调控机制。研究者发现基质生产和产孢是相互关联的。另外，细菌趋化、鞭毛组装和双组分调控系统在地衣芽孢杆菌生物膜形成过程中发挥了重要作用，这些途径中涉及的蛋白也是植物乳酸菌调控生物膜形成的关键调控因子。为今后防治其生物膜的研究提供了理论依据。

本研究使用经典的蛋白质组分析思路揭示了地衣芽孢杆菌生物膜形成和控制的调控机制。即先确定对照组和实验组，蛋白质酶解后通过TMT串联标签进行标记，之后进行质谱定量分析。获得蛋白质组数据后，筛选出实验组和对照组差异的蛋白质分子，进行GO富集，KEGG通路分析和蛋白质相互作用网络分析，从而揭示了生物膜形成和控制的调控机制。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956713519306188

拜谱生物团队解读

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