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目前DIA技术因其全局无偏、重复性、稳定性高的性质,已成为蛋白质组学领域最火的技术之一。众所周知,隔离窗口宽度直接影响了选择性和检测的动态范围,在实际的应用中,需要平衡隔离窗口,扫描速度,定性的选择性,以及定量准确性之间的关系。常规DDA蛋白质组采集的窗口是1.6Th到2Th,而DIA采集窗口普遍在10Th到25Th。在DIA中,共洗脱肽离子在预定义的质量隔离窗口中被共分离和碎片化,从而产生包含来自多个肽的片段离子的复杂光谱,这些片段离子被一起分析。相反,DDA的测序能力较低,但由于分离窗口较窄,特异性较高。

2023年6月6日,丹麦哥本哈根大学Jesper V. Olsen 教授团队联合赛默飞bioRxiv上发表了题为“Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth”的文章,该文章建立了1种基于Orbitrap Astral高分辨质谱的微小窗口(2Th)DIA方法,蛋白定性和定量效果超过相同条件下的DDA,通量可达到180SPD。同时将这种全新的2Th的超快速DIA方法进一步应用到酵母、临床样本中,可实现酵母15 min 4500个蛋白、人类细胞28 min近1万个蛋白的鉴定量。




研究结果

01

比较2Th窗口的DDA和DIA的结果

比较2Th窗口宽度的DDA和DIA的结果,发现在DDA模式下,MS/MS整体光谱强度更高(图1 d);但DIA鉴定量更高,定量蛋白的数目接近10000个,重复性好,蛋白变异系数(CV)低于20%的占比较高(图1 e-g)。再来评估Astral质量分析仪在MS/MS模式下提供的质量准确性,结果发现,MS1全扫描中确定的肽前体的绝对中位数质量偏差为0.95 ppm,所有匹配的碎片离子的绝对质量偏差中位数为1.88 ppm,与Orbitrap在15,000分辨率下的MS/MS测量结果相当(图1 h-j)。

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图1 DDA与DIA定性定量比较结果

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)


02

蛋白质组的全面研究

全面覆盖的蛋白质组学研究对于大规模系统生物学研究非常重要。研究者选用酵母细胞,评估Astral 3 Th DIA策略所需的时间,结果显示,8 min梯度即可得到4100个蛋白,平均酵母蛋白序列覆盖率为25%;上机梯度15 min以后可以达到4500个蛋白,覆盖率提高到30%(图2 a-b)。进一步使用人293T细胞评估窄窗DIA(2-Th)获得的人类蛋白质组覆盖率和灵敏度,结果显示,Astral高分辨质谱1 h上样量2μg时可以做到9879个蛋白,且即使是上样量减少到100ng时仍能覆盖88%的蛋白(图2 d)。通过进一步缩短梯度到28 min,12.5 min和5 min的测试,发现28 min上样1μg可以测到9619个蛋白,且平均CV低于3%(图2 f-g)。在相同的条件下,使用较短的梯度提高了MS信号(图2 f),并能够在不损失灵敏度的情况下提高扫描速度,从而在一半的采集时间内获得相似的蛋白质和肽覆盖(图2 g-h)。

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图2 酵母和人293T细胞的单针DIA鉴定数目的梯度上机分析结果

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)


03

微量样本的条件优化

观察到较低样本量的识别率减少,表明需要量身定制的DIA采集方法,特别是高灵敏度策略。研究人员通过比较不同采集条件下10 ng,25 ng和100 ng三种上样量的分析结果,发现上样量为100ng时,4Th窗口、7ms最大注入时间表现最优,可鉴定到8600个蛋白质,2Th和4Th、8Th差异不大;随着上样量的减少,较窄的分离窗口下蛋白采集数目下降(图3 b-c)。不同窗口大小的影响在质量范围内并不均匀,m/z较高的多肽受到的影响最大(图3 d)。因此,可根据上样量的不同调整窗口大小等建立最大化多肽覆盖率的最优方法,当上样量比较低时,可以通过扩大采集窗口弥补蛋白数目的下降。

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图3 微量样本的条件优化

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)


04

提高了无标记定量的精密度和准确度

接下来,为了评估窄窗口DIA方法的定量性能,研究人员分析了由不同比例人、酵母和大肠杆菌的混合样本。结果发现,三个物种28 min梯度检测到超过1.4万个蛋白,而Exploris 480质谱45 min梯度上机只有7000个蛋白(图4 b),表明Orbitrap Astral MS在更短的分析时间内识别出>2倍的蛋白质。根据差异倍数评价发现Astral高分辨质谱的方差显著低于Exploris 480(图4 c),进一步使用MaxLFQ algorithm和QUANT2.0算法评价差异倍数,发现Astral MS更好(图4 d-e),证明了窄窗口DIA策略用于蛋白质定量的优势。

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图4 不同物种混合比例的蛋白质组分析

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)

05

获取深层蛋白质组的快速多次采集策略

研究人员为了探索更高深度的蛋白质组,进行分馏分上机测试,结果发现200ng 46馏分5 min有效上机梯度(合计6小时),鉴定深度高达12179个蛋白,与以往的结果相比质谱采集时间减少了6倍、上样量减少5倍(图5 a),并且所有配对比较的皮尔逊相关系数都在0.9以上(图5 b)。如果合并34个馏分和46个馏分的生物学重复,鉴定深度达到12328个蛋白和246000个多肽,多肽覆盖蛋白的平均覆盖率可高达40%(图5 c)。随着馏分数从46个下降到34个再下降到23个,蛋白数目仍然可以达到46个馏分的99.4%和96.7%(图5 d)。除此之外,研究人员还鉴定了约2700个N-乙酰化位点,超过4000个磷酸化位点(图5 g)。

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图5 多馏分高深度的蛋白质组分析

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)


06

超快窄窗DIA支持系统生物学和临床蛋白质组学分析

研究人员使用这一高通量策略分析了70个基因敲除的酵母样本,定量了4500个蛋白质,93.7%的蛋白质可重复性定量,变异系数<10%,总共在80%的样品中检测到~4300个酵母蛋白(图6 c-d)。

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图6 DIA 3Th 180SPD方法应用到酵母突变体的系统生物学评价

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)


最后,研究人员使用Orbitrap Astral MS对16例临床样本进行检测,以实现大型临床队列所需的高通量。结果检测到5872个蛋白,其中定量5000个蛋白(图7 b)。这一快速分析有助于临床诊断疾病分层(图7 c-e),并发现至少3个biomarker蛋白,分别为SLC22A4,DEFA1B和MMP7,其中MMP7此前已经被确定为包膜痉挛的生物标志物(图7 d)。拜谱最新质谱仪Astral!超高通量、超深覆盖,诞生首篇蛋白组学(DIA)相关文章

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图7 DIA 2Th、180SPD方法应用到人乳腺包膜痉挛的临检样本评价

(图源:Ulises H Guzman.et al., BioRxiv, 2023)




研究结果


综上所述,该研究建立了1种基于Orbitrap Astral高分辨质谱的微小窗口(2Th)DIA方法,定性定量准确性等表现优异,通量可达到180SPD。同时将这种全新的2Th的超快速DIA方法进一步应用到酵母、临床样本中,可实现酵母15 min 4500个蛋白、人类细胞28 min近1万个蛋白的鉴定量。

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拜谱小结

临床蛋白质组学和系统生物学研究需要高通量LC-MS/MS分析,具有高定量准确性和精密度的深度蛋白质组覆盖。Orbitrap Astral高分辨质谱可实现28min检测到1万个蛋白的结果,实现了质量和通量的双重优势集合,助力探索更多未知。拜谱生物具备从DDA到DIA,从定性/定量蛋白组到修饰蛋白组,从常规样本到血液、微量/单细胞样本的完整蛋白质组学平台。此次首批引进Orbitrap Astral质谱仪,旨在利用最先进的技术,提供最优质的服务。让我们一起期待Orbitrap Astral质谱仪在实际应用中继续大放光彩吧!


参考文献:Ulises H Guzman.et al.Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth. BioRxiv 6,(2023).


—END—


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