拜谱全新研发|揭秘超高深度DIA乙酰化修饰蛋白质组
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蛋白质乙酰化修饰虽早在1964年便由Vincent Allfrey等提出,但其研究历程并不像磷酸化修饰一样一帆风顺。随着技术的不断发展,基于质谱的自下而上蛋白质组学逐渐成为蛋白质乙酰化和位点鉴定的主要方法。由于修饰蛋白的丰度远低于未修饰蛋白、修饰状态多变,乙酰化修饰蛋白质组研究首先要解决的问题就是修饰肽段的富集和分离。除此之外,对于这种修饰组学研究,检测方法也十分重要。近几年,DIA技术在磷酸化、组蛋白等修饰组学研究中广泛应用,而乙酰化修饰DIA技术的开发和文献却鲜有报道

基于此,拜谱生物全新推出超高深度DIA乙酰化修饰蛋白质组,采用CST抗体富集乙酰化修饰肽段,并结合DIA全息扫描方式,有效解决修饰肽段丰度低、检测难等问题,助力解锁乙酰化修饰功能、机制等研究。实验流程见下图。

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图1 拜谱生物超高深度DIA乙酰化修饰蛋白质组实验流程




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位点鉴定数量实现倍增,突破14000

基于质谱的修饰蛋白质组学研究通常有DDA和DIA两种定量方式,相较于DDA,DIA具有高通量、高重复性、全扫描的特点,更适合于修饰蛋白丰度低、修饰状态多变的修饰组学研究。此前,拜谱生物蛋白质乙酰化修饰组通常采用DDA(Label free、TMT)的技术路线,关于DDA的鉴定量,文献中以及拜谱生物的项目经验通常在3000-6000+个修饰位点不等。既然全新推出DIA乙酰化修饰组,那么DIA的实测数据到底表现如何?能否与DDA一战呢?

为解决上述疑惑,拜谱生物在使用拟南芥样本进行DIA乙酰化测试时,同时采用Label free的方式进行鉴定分析。由下图可知,同样的样本,DIA鉴定量在9000+个位点,高出Label free近一倍,并且在后续的开发测试中DIA鉴定量高达14000+个位点,为之后的数据分析打下了坚实的基础!

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图2 拜谱生物DIA与Label free位点鉴定量比较(拟南芥)




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图3 拜谱生物突破性DIA乙酰化位点鉴定数量(拟南芥)


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拜谱生物全新DIA乙酰化修饰组广泛适用于动/植物的组织、细胞等样品,具体送样建议见下表。

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表1 拜谱生物超高深度DIA乙酰化送样建议



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为了解蛋白质乙酰化修饰的功能与应用方向,首先来了解一下什么是乙酰化修饰。

蛋白质乙酰化修饰(acetylation)是指在酶(或非酶)的作用下将乙酰基团转移并添加在蛋白赖氨酸残基或蛋白N端上的过程。由此也可发现,乙酰化修饰主要分为两类,一类是由N乙酰转移酶(NATs)负责的蛋白N端乙酰化修饰;另一类是主要由赖氨酸乙酰化酶(KATs)和赖氨酸去乙酰化酶(KDACs)负责的蛋白赖氨酸乙酰化修饰,此类修饰是一种动态、可逆的翻译后修饰过程,在调控蛋白质功能、染色质结构和基因表达中起重要作用。

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图4 N端和赖氨酸蛋白乙酰化示意图

(图源:Ree R, et al., Exp Mol Med, 2018)




蛋白质乙酰化可影响到生命活动的各个过程,对于新生蛋白的成熟、细胞定位、蛋白质功能、染色质结构、基因转录、信号转导等方面十分重要,在动植物的生长发育与抗逆胁迫、代谢调控、肿瘤发生发展、神经退行性疾病等方面都有广泛应用。

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图5 拜谱生物DIA乙酰化应用方向




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蛋白质乙酰化通过调节DNA复制,RNA稳定性以及蛋白的折叠和替换等,影响动植物的生长发育。在胁迫条件下,乙酰化可通过信号转导、转录调控、酶活性调控发生相应防御机制。比如发育和环境刺激触发信号级联,导致HAT和HDAC基因的表达。组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)影响生化途径,调节激素代谢、ROS稳态、细胞壁完整性和膜稳定性,最终通过调控植物的抗逆性机制来控制植物在不同环境条件下的生长发育过程和抗逆性。

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图6 组蛋白乙酰化调节植物生长发育过程和抗逆性

(图源:Kumar V, et al., Cell Mol Life Sci, 2021)



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代谢调控是蛋白质乙酰化修饰的最重要功能。在人类肝组织中,几乎所有糖酵解、糖异生、三羧酸循环、尿素循环、脂肪酸代谢和糖原代谢中的酶均发生了乙酰化。此外,有研究表明,去乙酰化酶可以调节脂肪生成、线粒体功能、脂质代谢、肌纤维类型转换和糖异生等。比如HDAC1和HDAC2通过调节PPARγ活性冗余调节脂肪生成;HDAC3常通过使下游靶点去乙酰化,从而调节线粒体功能、脂质代谢和肌纤维类型转换。

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图7 去乙酰化酶对能量代谢的调节

(图源:Menzies KJ, et al., Nat Rev Endocrinol, 2016)


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蛋白质乙酰化与认知、学习、记忆等大脑功能密切相关。去乙酰化酶可调节蛋白稳态进而影响突触可塑性,或调控转录进而调节神经元轴突部位信号转导,靶向HDAC可能是神经退行性疾病的潜在治疗方案。有研究发现,阿尔兹海默症患者大脑中出现组蛋白乙酰化增加的现象,并且确定了组蛋白H3K27ac和H3K9ac修饰通过转录和染色质基因的失调来影响疾病进程,为早期干预阿尔兹海默症提供潜在的治疗方案。

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图8 阿尔兹海默病致病途径

(图源:Nativio R, et al. Nat Genet. 2020.)



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组蛋白乙酰化导致癌基因和抑癌基因的转录活性异常,非组蛋白乙酰化导致促癌因子和抑癌因子的稳定性和活性改变。因此,蛋白质乙酰化与肿瘤发生和发展密切相关,也是治疗干预的潜在靶点,目前已有4种HDAC抑制剂已被FDA批准用于癌症治疗。

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图9 蛋白质乙酰化与癌症特征的关系

(图源:Hu M, et al., Cancers (Basel), 2022)



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与其他修饰的crosstalk

赖氨酸的氨基可以发生多种修饰,包括乙酰化和其他酰化、甲基化、泛素化修饰等,这些修饰之间可以发生相互影响。p53是非组蛋白上翻译后修饰串扰的典型例子。p53在赖氨酸残基上的乙酰化直接与MDM2催化的泛素化竞争,从而抑制泛素-蛋白酶体依赖性降解,相反,MDM2也可以抑制CBP和p300催化的p53乙酰化。又如p65在Ser276和Ser536位点分别被MAPK和IKK通路上激酶磷酸化,磷酸化促进其被乙酰化,进而激活转录。因此,挖掘出不同修饰间的crosstalk信息,可以为理解不同条件下细胞信号的动态控制提供帮助。

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图10 乙酰化和其他翻译后修饰之间的Crosstalk

(图源:Narita T, et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2019)




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参考文献:

[1] Ree R, Varland S, Arnesen T. Spotlight on protein N-terminal acetylation. Exp Mol Med. 2018;50(7):1-13. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s12276-018-0116-z.

[2] Narita T, Weinert BT, Choudhary C. Functions and mechanisms of non-histone protein acetylation [published correction appears in Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Aug;20(8):508]. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(3):156-174. doi:10.1038/s41580-018-0081-3.

[3] Kumar V, Thakur JK, Prasad M. Histone acetylation dynamics regulating plant development and stress responses. Cell Mol Life Sci. 2021;78(10):4467-4486. doi:10.1007/s00018-021-03794-x.

[4] Zhao S, Xu W, Jiang W, et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. Science. 2010;327(5968):1000-1004. doi:10.1126/science.1179689.

[5] Menzies KJ, Zhang H, Katsyuba E, et al. Protein acetylation in metabolism-metabolites and cofactors. Nat Rev Endocrinol. 2016;12(1):43-60. doi:10.1038/nrendo.2015.181.

[6] Nativio R, Berger SL. An integrated multi-omics approach identifies epigenetic alterations associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 2020 Oct;52(10):1024-1035.

[7] Hu M, He F, Thompson EW, Ostrikov KK, Dai X. Lysine Acetylation, Cancer Hallmarks and Emerging Onco-Therapeutic Opportunities. Cancers (Basel). 2022;14(2):346. Published 2022 Jan 11. doi:10.3390/cancers14020346.




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