新品一站式方案|靶标发现与验证,赋能机制研究的深而精!


新品一站式方案|靶标发现与验证,赋能机制研究的深而精!

23年已经到了4月下旬,国自然初审结果也将要公布,想必各位老师也在紧锣密鼓地准备开展实验了。在这里,小编提前预祝各位老师获得基金支持资助。同时,为助力科研项目的开展,拜谱生物推出了机制研究的一站式解决方案,从多组学检测到寻找互作蛋白,赋能机制研究的深度和严谨性,助力高分文章发表。具体服务内容包括:1)多组学检测服务:蛋白组、修饰蛋白组、转录组、表观组等;2)功能验证服务:模型构建,敲除/敲低、过表达等;3)机制挖掘服务:互作蛋白组(IP+MS)、互作蛋白验证(CoIP、pull down、互作位点验证)等。

下面将会给大家详细介绍一整套完整的设计思路、实验方案、以及文献案例,请跟随小编一起来了解吧!

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对于做基础研究的课题组,大家的完整研究逻辑基本可以通过以下图示概括:先要确定一个待研靶分子A,这个A基因/蛋白一定能够引起明显表型,要证明A能够发挥D功能,如果要进行深度研究,就要探索A的上游驱动、下游靶点或分子修饰等调控机制。在这个过程中,每解决一个问题都能发文,如果能够解决的更深、更透彻、更精准,就能极大的为文章加分。


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基于上述科研基础研究思路,我们整理了一套完整而严谨的实验设计方案,如下图所示。

1)确定待研A基因/蛋白。这里推荐通过蛋白组或修饰蛋白组(如磷酸化)方法,蛋白是连接分子和表型的功能媒介,尤其相关酶(本质为蛋白质,如激酶)对底物的可逆调控,使得蛋白质成为理想的药物靶标和疾病标志物。

2)确定靶分子A的功能。构建细胞和组织模型,验证A对表型的影响。

3)挖掘A的直接调控机制。通过定量蛋白组、修饰蛋白组,结合互作蛋白组的方法寻找B蛋白,这一步是文章深度的升华,因此需要进行Co-IP、pull down、互作位点验证A和B的直接互作。

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接下来以一篇2022年发表在Journal of translational medicine的文献为启示,带大家一起梳理一下医学项目的典型发文思路:

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1

A基因/蛋白、C疾病的选择

不同的生理病理状态,与基因/蛋白的异常表达,或者修饰水平的异常有关,因此可以借助转录组、蛋白组、修饰蛋白组等方法来筛选差异,进一步结合与临床表型的相关性、文献报道等情况,锁定目标A基因/蛋白。

在这篇文章中,作者先前的研究证实了NCAPG影响有丝分裂,并发现在一些肿瘤中异常表达,如胶质瘤、前列腺癌和肝细胞癌(HCC)。HK Man的研究表明,全基因组敲除筛选已经确定NCAPG是HCC生长的重要致癌基因,靶向该基因将为HCC的诊断和治疗提供新方案。作者先前的研究中,证实了NCAPG在肝癌中有异常高表达。综上,该文章选择NCAPG(A基因/蛋白)和HCC(C疾病)作为研究对象。


2

体内外验证D功能

为了探究NCAPG在肝癌细胞增殖中的作用,分别构建了针对NCAPG的过表达质粒和敲低质粒转染到HCC细胞中,通过检测增殖相关蛋白PCNA表达量、细胞增殖能力和细胞簇形成数量,验证了NCAPG在体外能够促进肝癌细胞的增殖

 此外,20只小鼠随机分为4组(NCAPG过表达组和对照组;NCAPG敲除组和对照组),每组5只,通过测量肿瘤体积、HE染色和免疫组化分析、荧光原位杂交检测,数据表明NCAPG在体内可以促进肝癌细胞的增殖

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NCAPG促进肝癌细胞增殖


B分子机制

1)对基因编辑模型进行组学分析,筛选相关性分子和通路

为了确定NCAPG在HCC增殖中的机制,作者进行了蛋白质组分析和转录组分析。转录组测序结果显示,NCAPG敲低的癌症细胞中PTEN的表达较对照细胞显著增加(P<0.001),并且PI3K-AKT通路显著富集(图C)。(PTEN被认为是PI3K-AKT通路的关键负调控因子,通过去磷酸化对通路产生抑制作用)


2)功能相关性

进一步研究PI3K-AKT通路抑制剂MK2206是否能减弱肝癌的增殖。有趣的是,MK2206可以减弱NCAPG过表达造成的肿瘤增殖。综上所述,NCAPG对肝癌细胞增殖的影响是通过PI3K-AKT信号通路实现的,且与PTEN密切相关。


3)IP-MS寻找直接互作蛋白

为了揭示NCAPG与PTEN之间的深层关系,作者对可能与NCAPG相互作用的蛋白进行了蛋白质组学分析。结果发现,在数百种与NCAPG互作的蛋白中,酪蛋白激酶CKII与PI3K-AKT信号通路和PTEN关系最为密切(图F),(CKII可诱导PTEN磷酸化,导致PTEN的功能和转录受到抑制)。因此,作者推测NCAPG可能通过CKII影响PTEN的转录和表达。

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NCAPG基因编辑模型蛋白质组学分析和转录组测序


4)靶点验证互作蛋白,以及B机制验证

通过Co-IP分析发现,NCAPG和PTEN不直接结合,NCAPG和CKII直接作用。

 通过抑制表达和过表达CKII来验证CKII在NCAPG对PTEN的影响中发挥重要作用。结果证明,CKII确实是连接NCAPG和PTEN的关键成分。

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NCAPG与CKII直接互作,进而增强PTEN的磷酸化


4

A基因通过调控B机制影响C疾病的D功能

至此,一篇典型的机制研究文章就产生了。主体思路梳理:1)锁定A基因/蛋白,其在C疾病中异常表达,可借助转录组、蛋白组、修饰蛋白组等方法筛选待研靶分子。2)针对A构建基因编辑模型,阐明其在C疾病中的功能,影响体内外功能表型。3)通过组学分析筛选受A调控的B分子或通路,并结合IP-MS寻找互作蛋白。4)验证直接互作关系,最后针对B构建基因编辑模型验证功能恢复。

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NCAPG通过调控CKⅡ依赖的PTEN促进肝细胞癌的增殖


参考文献Zhang R, Ai J, Wang J, et al. NCAPG promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma through the CKII-dependent regulation of PTEN. J Transl Med. 2022;20(1):325. Published 2022 Jul 21. doi:10.1186/s12967-022-03519-z






拜谱小结

值得注意的是,该文章对下游机制B做了从筛选、互作、到验证的一系列完整的工作,而对于A基因的选择,主要是通过前期工作基础结合文献报道,如果想要提升课题的完整性和创新性,可以通过对临床/模型样本进行组学分析,以锁定有功能的创新A基因,这样就描绘了一个靶分子筛选、功能验证、到机制挖掘的完整科研故事,有望挑战更高分期刊。这里,拜谱生物可提供从靶分子筛选到互作蛋白验证的一站式服务,欢迎各位老师前来咨询!

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