新型信号传导途径|独特视角的亚硝基化修饰蛋白组究竟有哪些科研意义与特点?

一氧化氮(NO)作为第二信使通过两种途径对细胞产生影响,一种是cGMP信号通路,另一种与之平行的就是S-亚硝基化,也是NO介导的细胞调节的中心机制。亚硝基化基于氧化还原的信号传导,通过调节酶活性、亚细胞定位或蛋白质-蛋白质相互作用从而影响蛋白质的功能。亚硝基化被认为是一种与磷酸化相似的新型信号传导途径,这种高度保守的翻译后调控机制在多种生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。拜谱生物亚硝基化修饰蛋白组采用公认的生物素交换法结合质谱高通量技术,以无偏倚地发现整个蛋白质组中的亚硝基化,为各位科研工作者的研究带来“独特视角”,助力提升课题及文章水平。那么亚硝基化在医学和植物研究中具有哪些应用?该修饰有哪些重要的科研意义?以及该产品的特色优势,今天将为大家一一揭秘。


一、可逆的S-亚硝基化修饰

NO基团与蛋白的半胱氨酸巯基(S端)共价连接形成稳定的S-亚硝基硫醇,这种蛋白修饰被称为亚硝基化修饰(S-nitrosylation,简称SNO)。S-亚硝基化是一个动态可逆的过程,包括亚硝基化、转亚硝基化和去亚硝基化。S-亚硝基化和去亚硝基化的动态过程主要受细胞内S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)水平的调节,这是一种主要的NO生物活性物质。GSNO还原酶(GSNOR)通过还原GSNO实现底物的去硝基化。


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图1 蛋白质S -亚硝基化、转亚硝基化和去亚硝基化的生化过程

(图源:Vandana Sharma, et al.,Int J Mol Sci, 2021)



二、广泛发生的S-亚硝基化


研究发现,NO信号很大一部分通过S-亚硝基化储存并传递到特定的半胱氨酸(Cys)上。亚硝基化是一种普遍存在的翻译后修饰,影响超过3000个蛋白质。S-亚硝基化蛋白广泛分布于膜区、胞液、线粒体、细胞核、胞外基质、血管等,几乎调控所有信号通路,包括突触传递、转录因子、线粒体功能、铁稳态和受体/离子通道等,在调节组织稳态中发挥作用。并且亚硝基可以进一步通过转亚硝基化或被分泌,使整个组织得以调节。


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图2 发生S-亚硝基化的蛋白质

(图源:Saori Furuta, Trends Cancer, 2017)



三、植物蛋白S-亚硝基化


1)生物和非生物应激反应

在生物和非生物应激反应中,ROS和NO的爆发及其相互调节对早期信号传导至关重要,其中S-亚硝基化已被证明可以调节参与ROS稳态的关键酶活性。拟南芥GSNOR1突变引起细胞内NO水平显著增加和S-亚硝基化增加,导致具有严重发育缺陷和对生物和非生物胁迫响应改变的多效性表型。

2018年,中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室左建儒团队在Molecular cell发表研究论文,揭示了在植物缺氧反应中,S-亚硝基化诱导拟南芥GSNOR1选择性自噬,在NO信号通路和自噬之间建立了分子联系。

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图3 S-亚硝基化对植物免疫调节的影响

(图源:Sam Borrowman, et al., Free Radic Biol Med, 2023)

2)生长发育

NO在植物生长发育中的重要作用已被证实,广泛参与调控种子萌发、根发育、开花时间、花粉管导向和叶片衰老,已知NO的主要生物活性通过S-亚硝基化反应,因此研究S-亚硝基化将有助于更深入了解NO的信号机制。

2023年,山东农业大学段巧红和黄家保教授团队在Nature发文,拜谱生物有幸承接了亚硝基化修饰蛋白组检测服务,助力发现了介导授粉过程中相关蛋白的关键S-亚硝基化位点,验证了NO介导的S-亚硝基化在十字花科植物自交亲和授粉过程中发挥重要作用。

3)植物激素信号

研究表明,NO介导的S-亚硝基化也是调控植物激素信号通路的重要机制,S-亚硝基化分别正向和负向调节生长素信号和细胞分裂素信号。

4)叶绿素代谢和光合作用

叶绿素代谢和光合作用主要是氧化还原反应,这两个过程受到基于氧化还原的S-亚硝基化的广泛调控。亚硝基化修饰蛋白组研究发现,近三分之一的叶绿素代谢相关蛋白发生S-亚硝基化。同样,光合作用的明暗反应中大量关键成分都是S-亚硝基化的。在暗反应(卡尔文循环)中,S-亚硝基化蛋白全面覆盖了碳固定、还原和核酮糖再生三个阶段。



四、S-亚硝基化在疾病中的作用

亚硝基化在细胞和组织的氧化还原调控中起着至关重要的作用,因此其调控异常与病理状况密切相关。


1)神经退行性疾病

在生理条件下,亚硝基化NMDA受体(SNO-NMDAR)可防止其过度激活,由此产生的基础NO水平有助于正常的神经元功能。在病理条件下,过度激活突触外NMDA-nNOS通路(或神经胶质细胞中iNOS的表达)导致NO的过量产生。这些途径导致异常的亚硝基化蛋白形成,如SNO-GAPDH和SNO-PDI,增强病理过程。

此外,最新进展表明,直接和特异性的改变SNO-NMDAR或SNO-GAPDH的形成,在调节疾病相关过程中显示出一定的功效。因此,亚硝基化可能是广泛神经退行性疾病的潜在可行治疗靶点

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图4 生理病理条件下中枢神经系统的亚硝基化信号

(图源:Tomohiro Nakamura, et al., Trends Pharmacol Sci, 2016)


2)代谢性疾病,如2型糖尿病(T2DM)和胰岛素抵抗


S-亚硝基化调控胰岛素的整个作用范围,从合成和分泌,到其在靶组织中的信号传导和降解。因此,亚硝基化在与胰岛素相关的病理生理中都起着重要作用。胰岛素抵抗(IR)是一种病理状态,也是T2DM的主要特征。蛋白质亚硝基化调节胰岛素信号转导促进胰岛素抵抗的机制有三种。1) INSR-β、IRS1和AKT1的亚硝基化抑制它们的活性或促进其降解,破坏胰岛素信号。2) PPARγ和PDE3B的亚硝基化抑制其活性,损害脂肪细胞功能,从而导致脂肪细胞胰岛素抵抗。3) SIRT1的亚硝基化增强了NF- kB p65的乙酰化,从而激活了NF-κB的转录活性。活化的NF-κB启动促炎基因的表达,增强胰岛素抵抗。

2022年,美国凯斯西储大学医学院Jonathan S. Stamler团队表示,亚硝基化在细胞代谢中的影响越来越大,对2型糖尿病和胰岛素相关疾病中的亚硝基化也得到了重新关注,这将有利于代谢信号领域的研究。

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图5 胰岛素信号级联中的异常亚硝基化蛋白介导胰岛素抵抗

(图源:Hua-Lin Zhou, et al., Nat Rev Endocrinol, 2022)

3)肿瘤


S-亚硝基化也具有抑制肿瘤或促进肿瘤的作用,并涉及癌症进展的每个阶段。目前已研究的相关癌症有乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、胶质瘤、结肠癌和结直肠癌等。2019年,南京中医药大学医学与生命科学学院郭军教授团队在Theranostics中发表研究性论文,阐明了炎症微环境可诱导ezrin的S-亚硝基化修饰,进而促进细胞骨架与细胞膜间的机械转导,使非小细胞肺癌(NSCLC)获得更强的侵袭、转移能力。这项研究为重新认识NSCLC发生、发展机制以及癌症治疗提供了新的视野。

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图6 亚硝基化促进非小细胞肺癌侵袭和转移

(图源:Xiaolong Zhang, et al., Theranostics, 2019)


4)心血管疾病 

除了在癌症发病机制中发挥作用外,S-亚硝基化也在其他类型疾病的发展中发挥关键作用。S-亚硝基化在心脏保护方面起着有益作用。例如,缺血时心肌供氧降低,许多蛋白发生S-亚硝基化。这有助于心脏预先适应低氧水平和即将到来的引发氧化组织损伤的再灌注。这些蛋白质亚硝基化不仅可以降低细胞对氧的需求,防止细胞坏死和凋亡,还可以保护蛋白质在再灌注时不被氧化。

此外,在肾近端小管中,抑制参与中间代谢的酶的亚硝基化可以保护肾脏免受急性损伤。

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表1 与不同疾病有关的S-亚硝基化蛋白


5)肠道微生物-宿主信号

生物活性分子可以在微生物和宿主之间传递,影响宿主细胞功能,然而这种交流的通则尚不清楚。2019年,同样是美国凯斯西储大学的Jonathan S. Stamler团队在Cell中发表研究论文,发现微生物通过释放NO促进宿主蛋白的广泛S-亚硝基化,运用亚硝基化修饰蛋白组技术鉴定到1000种S-亚硝基化蛋白,选择功能保守且研究充分的ALG-1进一步分析,发现ALG-1上Cys691的亚硝基化会破坏microRNA活性,进而改变靶基因表达,影响宿主发育。该研究描绘了“肠道菌群-NO释放-宿主蛋白亚硝基化-调节microRNA活性-调节靶基因表达-影响宿主表型”的完整通路。

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图7 肠道微生物释放NO介导宿主蛋白的亚硝基化,影响宿主发育

(图源:Puneet Seth, et al., Cell, 2019)


 拜谱独家修饰——亚硝基化修饰蛋白组


亚硝基化修饰蛋白组是对生物样品中的亚硝基化位点/肽段进行全局无偏的定性定量分析,用于探究上述领域的生物学机制和靶标发现。以下是我公司该产品的特点:



1)公认的生物素交换法

在蛋白质S-亚硝基化检测分析方法中,最为广泛使用的是生物素交换法。首先将S-亚硝基化基团特异性地还原为自由巯基,进而使用生物素将其特异标记,被标记地半胱氨酸残基可进一步通过质谱方法进行检测分析。


2)项目经验丰富,亚硝基化位点鉴定量近1万

拜谱生物亚硝基化PTM平台拥有丰富的服务经验,目前承接过的样品类型有猪肉、牛肉、白菜、牛肌肉、人源细胞和小鼠肝脏组织等。其中,白菜相关项目结果已助力山东农业大学段巧红团队发表Nature


3)靶标发现与验证“一站式”分析

在生物信号通路研究、疾病标志物检测、药物开发中,我们推荐组合方案:亚硝基化修饰蛋白组+亚硝基化PRM验证,一站式解决靶标发现与验证。


4)类型丰富的半胱氨酸修饰组

蛋白质中的半胱氨酸是一个极其活跃的残基,可以进行多种翻译后修饰,除亚硝基化修饰蛋白组检测以外,我们还可提供棕榈酰化、谷胱甘肽化以及Total 氧化还原修饰蛋白组分析,以及次磺酸化和巯基化正在开发测试中。


5)送样建议

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参考文献:

(1) Sharma V, Fernando V, Letson J, et al. S-Nitrosylation in Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4600. Published 2021 Apr 27. doi:10.3390/ijms22094600

(2) Furuta S. Basal S-Nitrosylation Is the Guardian of Tissue Homeostasis. Trends Cancer. 2017;3(11):744-748. doi:10.1016/j.trecan.2017.09.003

(3) Borrowman S, Kapuganti JG, Loake GJ. Expanding roles for S-nitrosylation in the regulation of plant immunity. Free Radic Biol Med. 2023;194:357-368. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2022.12.009

(4) Nakamura T, Lipton SA. Protein S-Nitrosylation as a Therapeutic Target for Neurodegenerative Diseases. Trends Pharmacol Sci. 2016;37(1):73-84. doi:10.1016/j.tips.2015.10.002

(5) Zhou HL, Premont RT, Stamler JS. The manifold roles of protein S-nitrosylation in the life of insulin. Nat Rev Endocrinol. 2022;18(2):111-128. doi:10.1038/s41574-021-00583-1

(6) Zhang X, Li G, Guo Y, et al. Regulation of ezrin tension by S-nitrosylation mediates non-small cell lung cancer invasion and metastasis. Theranostics. 2019;9(9):2555-2571. Published 2019 Apr 13. doi:10.7150/thno.32479

(7) Seth P, Hsieh PN, Jamal S, et al. Regulation of MicroRNA Machinery and Development by Interspecies S-Nitrosylation. Cell. 2019;176(5):1014-1025.e12. doi:10.1016/j.cell.2019.01.037



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